胸腺素α(l)基因的表達(dá)及產(chǎn)物純化和活性檢測(cè)的初步研究.pdf

1、本試驗(yàn)旨在研究胸腺素α(l)的表達(dá)和活性檢測(cè)，探索出基因工程生產(chǎn)胸腺素α(l)的途徑和方法。試驗(yàn)根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)Tα(l)基因，由生物公司合成并連接到pMD18-T載體上。pMD18-T載體經(jīng)BamHⅠandHindⅢ雙酶切回收的胸腺素α(l)插入到同樣雙酶切回收的pET-32a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。連接質(zhì)粒測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，重組菌經(jīng)氨芐青霉素篩選，IPTG誘導(dǎo)，15％SDS-PAGE檢測(cè)Tα(l

2、)融合蛋白獲得了高水平表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白主要以可溶性形式存在于細(xì)胞周質(zhì)。誘導(dǎo)表達(dá)菌重懸于TE(pH8.0)后高壓破碎菌體，利用Ni2+能與融合蛋白上的多聚組氨酸結(jié)合進(jìn)行Ni2+柱親和層析純化，收集的洗脫蛋白峰15％SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。通過(guò)BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)測(cè)定純化胸腺素α(l)融合蛋白對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.重組質(zhì)粒pET-32a-Tα(l)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE

3、3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，用15％SDS-PAGE檢測(cè)胸腺素α(l)的表達(dá)。結(jié)果顯示，用5mmol/LIPTG連續(xù)誘導(dǎo)5h，目的蛋白可實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。
　　 2.重組菌體溶于TE后高壓破碎，濾膜過(guò)濾后進(jìn)行Ni2+柱親和層析純化，收集的洗脫蛋白峰15％SDS-PAGE確定純化效果。結(jié)果顯示，用Ni-NTA樹(shù)脂可有效地純化胸腺素α(l)。
　　 3.制備BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液，稀釋至適宜的細(xì)胞濃度，加入到細(xì)胞培養(yǎng)板，CO2