側(cè)孢短芽孢桿菌侵染性蛋白酶的表達(dá)及其隨機(jī)突變文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、植物寄生線蟲是植物的重要病害之一，已成為制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)良好發(fā)展的重要因素。生物防治線蟲具有對(duì)環(huán)境和人類危害小并且不會(huì)產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)勢(shì)，已成為線蟲防治的研究熱點(diǎn)。然而以天然活菌劑為基礎(chǔ)的生物殺線劑毒力小、穩(wěn)定性差對(duì)溫度敏感造成實(shí)際生防效果緩慢效率低下。因此，研究食線蟲微生物侵染線蟲的毒力因子及其作用的分子機(jī)制對(duì)提高生物殺線劑的穩(wěn)定性和毒力，促進(jìn)生物殺線劑的實(shí)際生防效率具有重要的意義。側(cè)孢短芽孢桿菌G4產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶BLG4是強(qiáng)殺線蟲的主

2、要毒力因子，是研究絲氨酸蛋白酶侵染線蟲機(jī)制的理想材料。本論文通過(guò)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)研究絲氨酸蛋白酶降解線蟲體壁并殺死線蟲的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)理。 通過(guò)對(duì)16S rRNA基因序列的分析，從分子水平上確認(rèn)出發(fā)菌就是具有高效殺線蟲毒力的Brevibacillus laterosporus G4菌株；利用單因素試驗(yàn)結(jié)合Plackett-Burman設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化B.laterosporus G4的發(fā)酵培養(yǎng)體系，獲得的培養(yǎng)體系搖瓶發(fā)

3、酵30小時(shí)蛋白酶活力可達(dá)12379 U/ml，比優(yōu)化前提高了5倍。 采用單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，獲得的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)電轉(zhuǎn)效率可達(dá)6.0×104 cfu/μgDNA，存活率達(dá)到3.O％；分別利用枯草芽孢桿菌整合型表達(dá)載體pSG1729B和自主獨(dú)立復(fù)制型表達(dá)載體pHY3000PLK構(gòu)建蛋白酶BLG4的異源重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功實(shí)現(xiàn)在B. sublilis WB600中的穩(wěn)定高效和高通量表達(dá)。 運(yùn)用易錯(cuò)PCR技術(shù)擴(kuò)增

4、蛋白酶BLG4的成熟肽片段，然后采用重疊延伸PCR技術(shù)獲得具有完整編碼區(qū)的突變基因，連接到pMD-T18 Simple Vector構(gòu)建庫(kù)容約為5.1×104 cfu、突變率為0.536％的高質(zhì)量蛋白酶BLG4的隨機(jī)突變文庫(kù)。應(yīng)用B。subtilis WB600表達(dá)體系構(gòu)建蛋白酶BLG4的隨機(jī)突變表達(dá)文庫(kù)，高通量篩選獲得熱穩(wěn)定性得到較大改善的突變體Mut-01。通過(guò)對(duì)突變體Mut-01的氨基酸序列和模擬的空間結(jié)構(gòu)分析表明，207位的Cy