芽孢桿菌漆酶基因隨機(jī)突變庫(kù)篩選與染料降解.pdf

1、漆酶作為一種重要催化劑，廣泛應(yīng)用于食品、制漿造紙及紙漿生物漂白等領(lǐng)域，但是漆酶在高pH及高溫條件下容易失活，限制了其應(yīng)用。本文以獲得耐高pH或耐高溫漆酶突變漆酶為目標(biāo)，對(duì)Error-prone PCR構(gòu)建成功的Bacillus subtilis LS03 CotA漆酶基因隨機(jī)突變庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，并對(duì)突變漆酶的酶學(xué)性質(zhì)和常見染料降解能力進(jìn)行系統(tǒng)分析比較。
　　利用96孔板初篩和大量定性復(fù)篩，最終獲得5株酶活較高的突變菌株:O19、

2、K14、K9、W3、W8，其中突變菌株O19粗酶活性比野生型提高了5.65倍;通過(guò)對(duì)突變漆酶同源建模獲得三維結(jié)構(gòu)表明5個(gè)突變漆酶相應(yīng)的氨基酸突變位點(diǎn)大部分位于酶分子第三結(jié)構(gòu)域的表面，其中只有突變漆酶O19的第260位氨基酸突變位于“口袋”結(jié)構(gòu)內(nèi)部表面。
　　突變漆酶O19和野生型漆酶CK經(jīng)His Trap HP分離純化，測(cè)得O19純酶的比酶活是CK的1.78倍， O19的異源表達(dá)量也明顯高于CK;同時(shí)對(duì)底物ABTS和SGZ的催化效

3、率及親和力都有顯著提高;突變型漆酶O19在pH耐受性和對(duì)金屬離子的影響方面有明顯的提升，其中K+、Mn2+、Co2+對(duì)O19的促進(jìn)作用提升了20％多;突變漆酶對(duì)部分抑制劑和表面活性劑抗性高于野生型漆酶，但是不具有高溫耐受性。
　　在降解4種常見的染料方面，O19降解活性亮藍(lán)和剛果紅的能力上均高于CK，降解率平均提高10％左右。研究了突變型漆酶降解靛藍(lán)過(guò)程中染料濃度、介體濃度、漆酶濃度三個(gè)因素對(duì)其降解的影響，正交試驗(yàn)得到三個(gè)因素中介