靈芝子實體多糖(綴合物)的純化、結構鑒定、分子改性和生物活性研究.pdf

1、靈芝(Ganoderma lucidum(Curtis：Fr.)p.Karst)在中國以及東南亞國家作為中草藥應用于治療各類疾病已有悠久的歷史，其在臨床上被應用于治療肝炎、慢性支氣管炎、哮喘、冠心病、心絞痛、高血壓、高血脂、神經衰弱、腫瘤等多種疾病。然而，靈芝應用于疾病的治療很大程度上依賴于古文獻對其藥理作用的記載，近年來，越來越多的研究者們對靈芝的作用機理和生物活性物質進行了研究。多糖(綴合物)作為靈芝中一種極為重要的生理活性物質，也

2、同時受到了越來越多的關注；由于過去分析和技術手段的落后，對多糖類物質的研究主要集中對其單糖成分等進行簡單的描述，很少深入地涉及對其結構較完整的闡述，所以給靈芝多糖藥物及保健產品開發(fā)沒有提供更深層次的資料，同時也沒有為多糖一些生理活性機理的研究建立結構信息方面的基礎。本文旨在通過對靈芝子實體多糖(綴合物)結構較深入地分析，同時結合化學改性和生理活性的研究，為進一步驗證靈芝的藥理活性以及促進靈芝相關產品或藥品的開發(fā)、提升靈芝產品或藥品的開發(fā)

3、深度和廣度提供更為深入的實驗依據。 1.靈芝子實體多糖(綴合物)分離純化及理化性質研究 119＃靈芝子實體經醇脫脂，超濾分級，弱陰離子柱層析(DEAE-Sepharose Fast Flow)，部分組分經Sevag法脫去游離蛋白，凝膠柱層析(Sephacryl S系列、CL-6B等)和HPLC鑒定獲得了二個均一多糖(LZ-C-1和LZ-D-1)和四個均一多糖肽LZ-B-1、LZ-C-2、LZ-C-3、LZ-D-4)和一個

4、均一多糖-蛋白復合物LZ-D-7。用高效液相色譜法、苯酚-硫酸法和BCA法對其分子量、總糖含量和蛋白(肽)含量進行鑒定，結果如下：LZ-B-1、LZ-C-3、、LZ-D-4為白色粉末狀樣品，LZ-D-1、LZ-C-1、LZ-C-2為白色絮狀樣品，LZ-D-7為白色纖維狀樣品；LZ-B-1、LZ-C-1、LZ-C-2、LZ-C-3和LZ-D-1均易溶于水、二甲基亞砜；LZ-D-4、LZ-D-7可溶于水、二甲亞砜，且LZ-D-7的溶解度比L

5、Z-D-4更小。 2.靈芝多糖(綴合物)的結構研究 2.1 靈芝多糖(綴合物)多糖亞基的結構研究 2.1.1 靈芝多糖肽LZ-B-1多糖亞基的結構研究 多糖肽LZ-B-1多糖亞基的一級重復結構單元主要由1，6-disubstituted-Galp，1，2，6-trisubstituted-Galp，1-substituted-Fucp，1，3-disubstituted-Glcp，1，4，6-tris

6、ubstituted-Glcp，1-substituted-Glcp等單糖殘基組成，其摩爾比大約為1：4：1：0.5：0.5：0.5，同時還有少量1，6-disubsituted-Glcp，1-substituted-Galp，1-substituted-Manp及1，3，6-trisubstituted-Manp等。 2.1.2 靈芝多糖LZ-C-1的結構研究 多糖LZ-C-1一級結構主要由1-substituted-

7、Fucp，1，2，6-trisubstituted-Galp，1-substituted-Glcp，1，6-disubstituted-Galp，1，3-disubstituted-Glcp和1，4，6-trisubstituted-Glcp等單糖殘基組成，其摩爾比約為1:1：2：4：2：2，并且含有少量1，6-disubstituted-Manp和其它類型的單糖殘基。 2.1.3 靈芝多糖LZ-D-1的結構研究 多糖L

8、Z-D-1一級結構主要由1-substituted-Fucp，1，2，6-trisubstituted-Galp，1，6-disubstituted-Galp和1，6-disubstituted-Glcp等單糖殘基組成，其摩爾比約為0.96：1.00：4.01：0.64，并且含有少量1，6-disubstituted-Manp，1，3-disubstituted-Glcp和其它類型的單糖殘基；其主要結構中可能存在以下重復單元：進一步通過

9、分析可知殘基1，6-disubstituted-Glcp可能與1，2，6-trisubstituted-Galp相連，同時可能每重復兩次以上重復單元連接一個1，6-disubstituted-Glcp。 2.1.4 靈芝多糖肽LZ-D-4多糖亞基的結構研究 經過分析，推斷出多糖肽LZ-D-4的多糖亞基的主要結構。 2.2 靈芝多糖(綴合物)糖亞基與蛋白(肽)亞基之間連接型式研究 對LZ-B-1、LZ-D-

10、4和LZ-D-7的多糖與蛋白質(肽)連接構型進行分析表明三種多糖一蛋白質(肽)復合物均可能為通過天冬氨基建立的N-連接構型。 3.靈芝多糖肽LZ-D-4分子改性研究 經過超濾、凝膠過濾所得的靈芝多糖肽均一體LZ-D-4，分子量為1.56×104Da，但其水溶性不是很理想；通過以氯磺酸-吡啶鹽(CSA： Pyr=1：6)為酯化試劑制得了一種LZ-D-4的硫酸酯，命名為LZ-D-9。LZ-D-9的得率為73％，分子量為1.3

11、0×104Da，硫含量為2.30％，取代度為0.12。 LZ-D-4在DMSO中以吡啶、乙酸酐為酯化試劑制得了一種乙酰酯多糖LZ-D-10，其得率為90％分子量為1.47×104Da，乙?；繛?％取代度為0.85。提出了使用1HNMR積分面積推導乙?；亢腿〈鹊姆椒ǎ⒔⒘颂菤埢鶠榱继堑挠嬎惴匠蹋?1)乙?；康挠嬎?乙?；?43×Aa/43×Aa+483×(A1+A2+……An)×100％

12、 2)乙?；娜〈鹊挠嬎悖?取代度(D．S．)指的是乙?；鶊F在每個糖環(huán)的數量，計算公式如下：D．S．=Aa/3×(A1+A2+……An) 4. 生物活性的研究 經過分離純化所得各組分進行了小鼠脾淋巴細胞(BALB/c)、小鼠淋巴癌細胞(L1210)和大鼠腎上腺嗜鉻細胞來源的未成熟神經元細胞(PC12)活性研究。 4.1 靈芝子實體多糖(綴合物)及其衍生物的對小鼠脾淋巴細胞刺激作用研究發(fā)現超濾后組分GL

13、PD對小鼠脾淋巴細胞的刺激作用明顯優(yōu)于總提取物GLP及另外兩個組分GLPB和GLPC，并且呈現一定的劑量依賴性，當樣品濃度為500μg/mL時，其刺激增殖率達到197％(10μg/mL陽性對照PHA刺激增殖率達到284％)，因此，超濾對獲得刺激小鼠脾淋巴細胞作用提高的組分起到了一定的效果；經DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析所得的各組分對刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖作用試驗結果表明樣品GLPBW、GLPBS2、

14、GLPDS1和GLPDS2對小鼠脾淋巴細胞的刺激作用明顯高于其它供試樣品，其樣品的最高刺激率分別為273.05％、280.10％、282.34％和260.04％，均接近于陽性對照(PHA)，且前面三個樣品具有濃度依賴性，其它樣品對小鼠脾淋巴細胞刺激的增殖作用均明顯小于陽性對照但具有一定的刺激作用，各樣品對淋巴細胞的刺激作用存在著一定濃度依賴性；研究了組分GLPB、GLPC、GLPD及其經離子層析后所得各組分之間的活性比較，發(fā)現經離子層析

15、后所得組分GLPBW、GLPBS2、GLPCS1、GLPCS2、GLPDS1、GLPDS2對小鼠脾淋巴細胞的刺激作用明顯地優(yōu)于其上一級組分，從生物活性上分析達到了一定的分離效果；研究了經凝膠層析所得各均一多糖(綴合物)對小鼠脾淋巴細胞的刺激作用，發(fā)現樣品LZ-D-7具有很強的刺激小鼠脾淋巴細胞的作用，當樣品濃度為50μg/mL時其對小鼠脾淋巴細胞的刺激增殖率為283.58％，與陽性對照相當，當樣品濃度為200μg/mL時其刺激率超過陽性

16、對照，當樣品濃度為500μg/mL達到333.15％，同時呈現了一定的濃度依賴性，樣品LZ-B-1、LZ-D-1也表現出了一定的刺激作用，但效果不如LZ-D-7，其余樣品對小鼠脾淋巴細胞有輕微的刺激作用；同時研究了LZ-D-4及其硫酸化和乙?；苌飳π∈笃⒘馨图毎拇碳ぷ饔?，發(fā)現硫酸化樣品LZ-D-9對小鼠脾淋巴細胞的刺激作用沒有明顯變化，但乙酰化樣品LZ-D-10對小鼠脾淋巴細胞的刺激作用有所增加，說明了乙?；瘡囊欢ǔ潭壬夏芴岣叨嗵?/p>

17、的免疫活性。 4.2 靈芝子實體多糖(綴合物)及其衍生物的對L1210細胞毒毒性研究 實驗表明大部分組分對L1210均沒有體外抑制作用，只有樣品GLP、GLPB、LZ-D-4及硫酸化樣品LZ-D-9具有輕微的抑制腫瘤作用(細胞毒毒性)。4.3 靈芝子實體多糖(綴合物)及其衍生物對PC12細胞的研究 結果表明樣品GLP、GLPB、GLPC、GLPD、GLPBS1、GLPCS1、GLPCS2、GLPDS1對經H2O2