金耳子實(shí)體多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、分子修飾和生物活性的研究.pdf

1、金耳（Tremella aurantialba Bandoni et Zang），俗稱腦耳、金木耳，是我國一種稀有的珍貴食用菌和藥用菌，金耳膠質(zhì)細(xì)膩，清潤可口，其滋補(bǔ)營養(yǎng)價(jià)值，優(yōu)于銀耳、黑木耳等其他膠質(zhì)菌，是“三耳”（金耳、銀耳、黑木耳）中的佼佼者，具有化痰、止咳、定喘、調(diào)氣、平肝陽之功效，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金耳多糖主要具有增強(qiáng)免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗血栓等作用。目前關(guān)于金耳的研究主要集中于對金耳的人工馴化、營養(yǎng)成分和生物活性的研究，

2、多糖作為金耳的主要生理活性成分之一，也受到了國內(nèi)外越來越多的關(guān)注，但由于過去多糖技術(shù)和分析手段的落后，金耳多糖的化學(xué)研究主要集中于對其基本的理化性質(zhì)、單糖組成和連接位點(diǎn)的分析，多糖的藥理活性研究也主要是關(guān)于粗多糖的研究，而對均一多糖的結(jié)構(gòu)分析和生物活性還很少涉及。為了系統(tǒng)地研究金耳子實(shí)體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，本研究對金耳子實(shí)體多糖進(jìn)行了提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、分子修飾和生物活性研究，為合理開發(fā)和利用金耳資源奠定扎實(shí)可靠的理論基礎(chǔ)

3、。
　　 1金耳子實(shí)體多糖分離純化和理化性質(zhì)的研究
　　 金耳子實(shí)體經(jīng)乙醇脫脂和熱水抽提得粗提物TAP、TAP經(jīng)超濾分級(jí)得三組分TAPA、TAPB和TAPC，總得率為3.84％，其中TAPA最高，為3.67％, TAPA的多糖含量也比較高，為62.2％。 TAPA經(jīng)陰離子交換后得到TAPA1-TAPA5五個(gè)組分，其中TAPA1的得率在五個(gè)組分中最高為31.6％; TAPA1經(jīng)Sephacryl S-500凝膠層析并經(jīng)檢測

4、后得到三個(gè)均一多糖：TAPA11、TAPA21和TAPA51。三個(gè)均一多糖均為白色絮狀樣品，均易溶于水，溫度升高溶解度升高；在常溫和加溫條件下均不溶于二甲亞砜。
　　 2金耳子實(shí)體多糖的結(jié)構(gòu)鑒定
　　 通過單糖組成分析、甲基化分析、紅外譜和NMR譜等技術(shù)，研究了金耳子實(shí)體的2種均一多糖TAPA11和TAPA21的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 2.1 TAPA11的結(jié)構(gòu)鑒定
　　 均一多糖TAPA11的分子量為1.35

5、×106，單糖組成主要由甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸組成，其摩爾比約為5:4:1，并含有少量葡萄糖、半乳糖醛酸，是一種酸性多糖；甲基化結(jié)果表明，甘露糖主要以1,3-、1，2，3-、1，2,3，4-、1，4-和1-連接；木糖主要以1，2-、1,3-、1，4-和1-連接；葡萄醛酸以1.4-連接.由NMR譜進(jìn)一步分析結(jié)果表明，得出TAPA11的四個(gè)結(jié)構(gòu)片段為：
　　 [→3)-α-DManp-(1→3-α- D-Manp1→3)－α-D-

6、Munp-(1→)nⅠ
　　 D B A
　　 β-D-Man p-(1→3)-β-D-Xyp-(1-4)－β-D-GluAp-(1→2)-α-D-Manp-(1→Ⅱ
　　 E K G A
　　 α-D-Man-(1→4-β-D-Xylp-(1→2)-α-D-Manp-(1→Ⅲ
　　 c H D
　　 β-D-Xylp-(1→2)-β-D-Xylp-(1→4-α-D-Manp-(1Ⅳ

7、>　　 J F D
　　 因此，TAPA11可能的結(jié)構(gòu)為：
　　 β-D-Manp-(1→3）
　　 E|
　　 α-D-Manp-(1→4）β-D-Xylp-(1→4）
　　 C| X|
　　 β-D-Xylp-(1→2)β-D-GlnAp-(1→2)
　　 H| G|
　　 [→3)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(→]

8、n
　　 |D B A
　　 β-D-Xylp-(1→2)-β-D-Xlp-(1→4)
　　 J F
　　 2.2 TAPA21的結(jié)構(gòu)鑒定
　　 均一多糖TAPA21的相對分子質(zhì)量為7.6×105，單糖組成和摩爾比為Man:Xyl:GluA=3:3:1，并含有少量Glc和GalA，是一含葡萄糖醛酸的酸性多糖，結(jié)合甲基化結(jié)果和NMR圖譜分析結(jié)果，表明TAPA21的一級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由以下三個(gè)片段組成：<

9、br>　　 →3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→1
　　 A C B
　　 β-D-GluA-(1→3)-β-D-Xyl-(1→2）－α-D-Man-(1→Ⅱ
　　 G D A
　　 β-D-Xyl-(1→2）-β－D-Xyl-(1→4）-α-D-Man-(1→Ⅲ
　　 E F B
　　 片段Ⅰ組成主鏈，是由α-(1→3)糖苷鍵連接的甘露

10、聚糖組成的，Ⅱ和Ⅲ組成側(cè)鏈，分別連接于主鏈Ⅰ的2位和4位。TAPA21的一級(jí)結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元可能如下所示：
　　 β-D-Xyl-(1→2)-β-D-Xyl-(1→4）
　　 E F|
　　 β→3)-α-D-Ma n-(1→3)-α-D-Man13)-α-D-Man-(1→ln
　　 |A e B
　　 β-D-GlnA-（1→3)-β-D-Xyl-(1→2)
　　 G D
　　

11、3均一多糖TAPA11的分子修飾的研究
　　 為了進(jìn)一步提高均一多糖TAPA11的生物學(xué)活性及研究多糖的構(gòu)效關(guān)系，對TAPA11進(jìn)行了衍生化。采用氯磺酸-吡啶法制備了硫酸酯化多糖TAPA11-s，得率為65.25％，利用BaSO4濁度法測得硫酸基含量為2.88％，取代度為0.05；并對TAPA11-s的紅外光譜和核磁共振波譜進(jìn)行了初步分析，結(jié)果均證實(shí)了與計(jì)算結(jié)果相吻合的低取代度；均一多糖溶解于DMSO中以吡啶、乙酸酐為酯化試劑制

12、備了TAPA11的乙酰化多糖衍生物TAPA11-ac，得率分別為56％，乙?；繛?.81％，取代度為0.23; TAPA11經(jīng)脫乙?；饔弥频昧薚APA11的脫乙酰基衍生物TAPA11-deac，得率為75％，經(jīng)測定乙?；亢腿〈染鶠?，表明了通過乙?；饔靡阴；淹耆幻撊?。
　　 4金耳子實(shí)體生物活性的研究
　　 分別選擇了小鼠(BALB/C57)脾淋巴細(xì)胞、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、來源于大鼠腎上腺嗜鉻

13、細(xì)胞未成熟神經(jīng)元的細(xì)胞系PC12，以脾淋巴細(xì)胞的增殖活性、NO的釋放量和H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷修復(fù)活性三個(gè)指標(biāo)考察了金耳子實(shí)體多糖及其衍生物的生物活性。
　　 4.1金耳多糖及其衍生物對刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖作用作用研究
　　 采用不同溶劑對金耳子實(shí)體依次提取所得組分四組分TA冷水提（TAP1）、TA熱水提（TAP）、TA草酸銨提（TAP2）、TA堿提（TAP3）對淋巴細(xì)胞均有一定的增殖作用，TAP2的活性最低

14、，其他三組分的活性相當(dāng)，其中TAP1、TAP的刺激增殖的作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性關(guān)系；四個(gè)組分在試驗(yàn)濃度下的活性均低陽性對照的活性。綜合考慮四個(gè)組分的提取得率和提取工藝簡化程度，選擇了TAP做進(jìn)一步的分離純化的研究材料。粗多糖TAP經(jīng)超濾后所得三組分中，TAPA和TAPB相比原樣品TAP活性有所提高，TAPA活性提高顯著，且呈一定的劑量依賴性，TAPA在高濃度時(shí)刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性接近于陽性對照的活性。TAPA經(jīng)陰離子交換層析后所得各

15、組分中，組分TAPA1刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性隨濃度升高而活性增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。TAPA1經(jīng)凝膠層析分離得到的三種均一組分TAPA11、TAPA21和TAPA51中，TAPA11的體外免疫刺激活性最好，高于TAPA在相同濃度下的增殖率。三種衍生物TAPA11-s、TAPA11-ac和TAPA11-deac中，TAPA11-s免疫活性最好，在高濃度下刺激淋巴細(xì)胞增殖的活性高于陽性對照，說明TAPA11經(jīng)硫酸酯化可以提高其生物活性。

16、>　　 4.2金耳均一多糖TAPA11及其衍生物對小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7生成NO的影響
　　 TAPA11對RAW264.7產(chǎn)生NO的量在10μg/ml時(shí)就出現(xiàn)明顯增加，且與樣品濃度呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系，50μg/ml時(shí)釋放NO的量與陽性對照LPS（1μg/ml）相當(dāng)；三種衍生物中，乙酰化衍生物TAPA11-ac作用稍明顯，50μg/ml的NO的釋放量達(dá)到了214％，但低于陽性對照LPS(1μg/ml)的水平(258.

17、9％)，其次是硫酸化衍生物TAPA11-s,50μg/ml的NO釋放量為185.7％，脫乙酰基衍生物TAPA11-deac最差（50μg/ml的NO釋放量僅為158.7％），結(jié)果表明多糖對巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO的影響作用有可能不僅與多糖上的取代基有關(guān)系，還可能與取代基的含量（或取代度）有關(guān)。
　　 43金耳子實(shí)體多糖及其衍生物對經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化損傷的修復(fù)活性的研究
　　 研究了總提取物TAP、超濾后

18、各組分、陰離子層析交換所得各組分、凝膠層析所得的均一多糖及衍生物對經(jīng)H2O2損傷的PC12的修復(fù)作用。結(jié)果表明，樣品TAP、 TAPA、 TAPB、 TAPC、 TAPA1-TAPA5、 TAPA11對經(jīng)H2O2損傷的PC12細(xì)胞的均具有一定的修復(fù)作用；乙?；瘶悠稵APA11-ac的修復(fù)作用在500mg/mL時(shí)的修復(fù)率157.63％，與陽性對照NGF的修復(fù)率(166.8％)相當(dāng)，可見乙?；揎椇蟮臉悠放c原樣品TAPA11相比較可以明顯提