金耳子實體多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、分子修飾和生物活性的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、金耳(Tremella aurantialba Bandoni et Zang),俗稱腦耳、金木耳,是我國一種稀有的珍貴食用菌和藥用菌,金耳膠質(zhì)細膩,清潤可口,其滋補營養(yǎng)價值,優(yōu)于銀耳、黑木耳等其他膠質(zhì)菌,是“三耳”(金耳、銀耳、黑木耳)中的佼佼者,具有化痰、止咳、定喘、調(diào)氣、平肝陽之功效,據(jù)文獻報道,金耳多糖主要具有增強免疫、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗血栓等作用。目前關(guān)于金耳的研究主要集中于對金耳的人工馴化、營養(yǎng)成分和生物活性的研究,

2、多糖作為金耳的主要生理活性成分之一,也受到了國內(nèi)外越來越多的關(guān)注,但由于過去多糖技術(shù)和分析手段的落后,金耳多糖的化學(xué)研究主要集中于對其基本的理化性質(zhì)、單糖組成和連接位點的分析,多糖的藥理活性研究也主要是關(guān)于粗多糖的研究,而對均一多糖的結(jié)構(gòu)分析和生物活性還很少涉及。為了系統(tǒng)地研究金耳子實體多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性,本研究對金耳子實體多糖進行了提取、分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、分子修飾和生物活性研究,為合理開發(fā)和利用金耳資源奠定扎實可靠的理論基礎(chǔ)

3、。
   1金耳子實體多糖分離純化和理化性質(zhì)的研究
   金耳子實體經(jīng)乙醇脫脂和熱水抽提得粗提物TAP、TAP經(jīng)超濾分級得三組分TAPA、TAPB和TAPC,總得率為3.84%,其中TAPA最高,為3.67%, TAPA的多糖含量也比較高,為62.2%。 TAPA經(jīng)陰離子交換后得到TAPA1-TAPA5五個組分,其中TAPA1的得率在五個組分中最高為31.6%; TAPA1經(jīng)Sephacryl S-500凝膠層析并經(jīng)檢測

4、后得到三個均一多糖:TAPA11、TAPA21和TAPA51。三個均一多糖均為白色絮狀樣品,均易溶于水,溫度升高溶解度升高;在常溫和加溫條件下均不溶于二甲亞砜。
   2金耳子實體多糖的結(jié)構(gòu)鑒定
   通過單糖組成分析、甲基化分析、紅外譜和NMR譜等技術(shù),研究了金耳子實體的2種均一多糖TAPA11和TAPA21的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
   2.1 TAPA11的結(jié)構(gòu)鑒定
   均一多糖TAPA11的分子量為1.35

5、×106,單糖組成主要由甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸組成,其摩爾比約為5:4:1,并含有少量葡萄糖、半乳糖醛酸,是一種酸性多糖;甲基化結(jié)果表明,甘露糖主要以1,3-、1,2,3-、1,2,3,4-、1,4-和1-連接;木糖主要以1,2-、1,3-、1,4-和1-連接;葡萄醛酸以1.4-連接.由NMR譜進一步分析結(jié)果表明,得出TAPA11的四個結(jié)構(gòu)片段為:
   [→3)-α-DManp-(1→3-α- D-Manp1→3)-α-D-

6、Munp-(1→)nⅠ
   D B A
   β-D-Man p-(1→3)-β-D-Xyp-(1-4)-β-D-GluAp-(1→2)-α-D-Manp-(1→Ⅱ
   E K G A
   α-D-Man-(1→4-β-D-Xylp-(1→2)-α-D-Manp-(1→Ⅲ
   c H D
   β-D-Xylp-(1→2)-β-D-Xylp-(1→4-α-D-Manp-(1Ⅳ

7、>   J F D
   因此,TAPA11可能的結(jié)構(gòu)為:
   β-D-Manp-(1→3)
   E|
   α-D-Manp-(1→4)β-D-Xylp-(1→4)
   C| X|
   β-D-Xylp-(1→2)β-D-GlnAp-(1→2)
   H| G|
   [→3)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(→]

8、n
   |D B A
   β-D-Xylp-(1→2)-β-D-Xlp-(1→4)
   J F
   2.2 TAPA21的結(jié)構(gòu)鑒定
   均一多糖TAPA21的相對分子質(zhì)量為7.6×105,單糖組成和摩爾比為Man:Xyl:GluA=3:3:1,并含有少量Glc和GalA,是一含葡萄糖醛酸的酸性多糖,結(jié)合甲基化結(jié)果和NMR圖譜分析結(jié)果,表明TAPA21的一級結(jié)構(gòu)主要是由以下三個片段組成:<

9、br>   →3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→3)-α-D-Man-(1→1
   A C B
   β-D-GluA-(1→3)-β-D-Xyl-(1→2)-α-D-Man-(1→Ⅱ
   G D A
   β-D-Xyl-(1→2)-β-D-Xyl-(1→4)-α-D-Man-(1→Ⅲ
   E F B
   片段Ⅰ組成主鏈,是由α-(1→3)糖苷鍵連接的甘露

10、聚糖組成的,Ⅱ和Ⅲ組成側(cè)鏈,分別連接于主鏈Ⅰ的2位和4位。TAPA21的一級結(jié)構(gòu)的重復(fù)單元可能如下所示:
   β-D-Xyl-(1→2)-β-D-Xyl-(1→4)
   E F|
   β→3)-α-D-Ma n-(1→3)-α-D-Man13)-α-D-Man-(1→ln
   |A e B
   β-D-GlnA-(1→3)-β-D-Xyl-(1→2)
   G D
  

11、3均一多糖TAPA11的分子修飾的研究
   為了進一步提高均一多糖TAPA11的生物學(xué)活性及研究多糖的構(gòu)效關(guān)系,對TAPA11進行了衍生化。采用氯磺酸-吡啶法制備了硫酸酯化多糖TAPA11-s,得率為65.25%,利用BaSO4濁度法測得硫酸基含量為2.88%,取代度為0.05;并對TAPA11-s的紅外光譜和核磁共振波譜進行了初步分析,結(jié)果均證實了與計算結(jié)果相吻合的低取代度;均一多糖溶解于DMSO中以吡啶、乙酸酐為酯化試劑制

12、備了TAPA11的乙?;嗵茄苌颰APA11-ac,得率分別為56%,乙?;繛?.81%,取代度為0.23; TAPA11經(jīng)脫乙?;饔弥频昧薚APA11的脫乙酰基衍生物TAPA11-deac,得率為75%,經(jīng)測定乙?;亢腿〈染鶠?,表明了通過乙?;饔靡阴;淹耆幻撊?。
   4金耳子實體生物活性的研究
   分別選擇了小鼠(BALB/C57)脾淋巴細胞、小鼠巨噬細胞RAW264.7、來源于大鼠腎上腺嗜鉻

13、細胞未成熟神經(jīng)元的細胞系PC12,以脾淋巴細胞的增殖活性、NO的釋放量和H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞損傷修復(fù)活性三個指標考察了金耳子實體多糖及其衍生物的生物活性。
   4.1金耳多糖及其衍生物對刺激小鼠脾淋巴細胞的增殖作用作用研究
   采用不同溶劑對金耳子實體依次提取所得組分四組分TA冷水提(TAP1)、TA熱水提(TAP)、TA草酸銨提(TAP2)、TA堿提(TAP3)對淋巴細胞均有一定的增殖作用,TAP2的活性最低

14、,其他三組分的活性相當,其中TAP1、TAP的刺激增殖的作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性關(guān)系;四個組分在試驗濃度下的活性均低陽性對照的活性。綜合考慮四個組分的提取得率和提取工藝簡化程度,選擇了TAP做進一步的分離純化的研究材料。粗多糖TAP經(jīng)超濾后所得三組分中,TAPA和TAPB相比原樣品TAP活性有所提高,TAPA活性提高顯著,且呈一定的劑量依賴性,TAPA在高濃度時刺激淋巴細胞增殖的活性接近于陽性對照的活性。TAPA經(jīng)陰離子交換層析后所得各

15、組分中,組分TAPA1刺激淋巴細胞增殖的活性隨濃度升高而活性增加,呈現(xiàn)濃度依賴性。TAPA1經(jīng)凝膠層析分離得到的三種均一組分TAPA11、TAPA21和TAPA51中,TAPA11的體外免疫刺激活性最好,高于TAPA在相同濃度下的增殖率。三種衍生物TAPA11-s、TAPA11-ac和TAPA11-deac中,TAPA11-s免疫活性最好,在高濃度下刺激淋巴細胞增殖的活性高于陽性對照,說明TAPA11經(jīng)硫酸酯化可以提高其生物活性。

16、>   4.2金耳均一多糖TAPA11及其衍生物對小鼠巨噬細胞株RAW264.7生成NO的影響
   TAPA11對RAW264.7產(chǎn)生NO的量在10μg/ml時就出現(xiàn)明顯增加,且與樣品濃度呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系,50μg/ml時釋放NO的量與陽性對照LPS(1μg/ml)相當;三種衍生物中,乙酰化衍生物TAPA11-ac作用稍明顯,50μg/ml的NO的釋放量達到了214%,但低于陽性對照LPS(1μg/ml)的水平(258.

17、9%),其次是硫酸化衍生物TAPA11-s,50μg/ml的NO釋放量為185.7%,脫乙?;苌颰APA11-deac最差(50μg/ml的NO釋放量僅為158.7%),結(jié)果表明多糖對巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的影響作用有可能不僅與多糖上的取代基有關(guān)系,還可能與取代基的含量(或取代度)有關(guān)。
   43金耳子實體多糖及其衍生物對經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的PC12氧化損傷的修復(fù)活性的研究
   研究了總提取物TAP、超濾后

18、各組分、陰離子層析交換所得各組分、凝膠層析所得的均一多糖及衍生物對經(jīng)H2O2損傷的PC12的修復(fù)作用。結(jié)果表明,樣品TAP、 TAPA、 TAPB、 TAPC、 TAPA1-TAPA5、 TAPA11對經(jīng)H2O2損傷的PC12細胞的均具有一定的修復(fù)作用;乙?;瘶悠稵APA11-ac的修復(fù)作用在500mg/mL時的修復(fù)率157.63%,與陽性對照NGF的修復(fù)率(166.8%)相當,可見乙酰化修飾后的樣品與原樣品TAPA11相比較可以明顯提

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