黃傘子實(shí)體多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的研究.pdf

1、黃傘（Pholiota adipose(Fr.)Quel），又名柳蘑、黃蘑、多脂鱗傘，屬于層菌綱，傘菌目，球蓋菇科，鱗傘屬，是一種具備較高研究開發(fā)價(jià)值的食藥用真菌。黃傘子實(shí)體不僅菇質(zhì)脆嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，而且其多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血脂、抗菌、抗氧化、抗衰老等多方面的生物活性。目前為止，關(guān)于黃傘的研究大多集中在多糖提取工藝和粗多糖活性分析等方面，對黃傘子實(shí)體多糖的純化、結(jié)構(gòu)和純化多糖級分活性的研究還未見有報(bào)道。本研究以黃

2、傘子實(shí)體為試材，對其多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及體外抗氧化活性等方面進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，對開發(fā)利用我國珍貴的藥用真菌資源具有重要的學(xué)術(shù)意義，對開發(fā)天然抗氧化劑也具有一定的實(shí)用價(jià)值。研究結(jié)果如下：
　　 1.黃傘子實(shí)體多糖提取工藝研究通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了水提醇沉法提取黃傘子實(shí)體多糖較佳的提取工藝，提取溫度為100 ℃，時(shí)間4h，水料比為20:1v/w，浸提次數(shù)1次，此工藝下黃傘子實(shí)體多糖的得率高達(dá)8.19％。
　　

3、 2.黃傘子實(shí)體多糖分離純化研究黃傘子實(shí)體多糖通過脫蛋白、脫色、DEAE Sepharose Fast Flow 離子交換柱層析和superdeXTM 200 凝膠柱層析分離純化，得到3個(gè)黃傘子實(shí)體多糖組分（PAP1-1、PAP1-2和PAP2-1），經(jīng)紫外掃描和HPSEC分析,3種多糖組分為基本不含蛋白和核酸的均一組分，純度分別為97.23％、98.85％和98.91％。
　　 3.多糖單糖組成檢測方法的建立（1）糖腈乙酰酯

4、衍生化氣相色譜法色譜條件：DB-23 石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25 μm），F(xiàn)ID 檢測器，檢測器溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱溫220 ℃；進(jìn)樣量0.5 μL，柱流量1.0mL/min，分流比20:1，在20min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了8種單糖的分離；
　　 （2）非衍生化HPLC-ELSD法色譜條件：Prevail Carbohydrate ES Column(4.6mm×250mm，5μm），柱溫25 ℃；流

5、動(dòng)相為乙腈-水（85:15），流速0.8mL/min；ELSD 檢測器溫度80 ℃，輔助氣（N2）壓力3.5bar，增益（gain）為6，在35min中內(nèi)實(shí)現(xiàn)了葡萄糖醛酸和6種單糖的分離。
　　 4.黃傘子實(shí)體均一多糖組分的結(jié)構(gòu)分析通過HPSEC、GC、HPLC-ELSD、IR和NMR(1 H NMR和13 C NMR）等方法，初步鑒定了黃傘子實(shí)體均一多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　 （1）PAP1-1分子量約為2.3×10 6

6、Da，由α-D 吡喃葡萄糖殘基組成的葡聚糖，基本不含糖醛酸，多糖主鏈由1-4和1-6 糖苷鍵連接；
　　 （2）PAP1-2分子量約為8.8×10 3 Da，由D-吡喃葡萄糖和鼠李糖組成，摩爾比為3.55:1，基本不含糖醛酸，可能同時(shí)含有α和β型糖苷鍵，主鏈由1-6 糖苷鍵連接；
　　 （3）PAP2-1分子量約為2.1×10 6 Da，由α-D 吡喃葡萄糖殘基組成的葡聚糖，基本不含糖醛酸，多糖主鏈由1-4和1-6 糖苷

7、鍵連接。
　　 5.黃傘子實(shí)體多糖的生物活性分析（1）通過觀察提取純化的黃傘子實(shí)體多糖（PAP）對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的（PEM Φ）
　　 激活效應(yīng)，結(jié)果表明黃傘子實(shí)體多糖能有效地激活巨噬細(xì)胞，通過增強(qiáng)細(xì)胞因IL-1 β子分泌、增強(qiáng)NO的產(chǎn)生水平、增強(qiáng)其吞噬功能及體外殺傷活性等多種途經(jīng)來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，并可起到抑制腫瘤的生長的效應(yīng)；
　　 （2）黃傘子實(shí)體多糖（PAP）灌胃給藥，對小鼠S180 實(shí)體瘤有一定的抑瘤作用

8、，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，灌胃劑量為1.5mg/kg·d 時(shí)，抑瘤率為38.46％；
　　 （3）通過密閉缺氧實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量的黃傘子實(shí)體多糖（PAP）均能不同程度地延長小鼠在密閉條件下的存活時(shí)間，其中以3.0mg/kg·d 效果最好，存活時(shí)間比對照組延長了38.9％；
　　 （4）通過檢測PAP、PAP1-1、PAP1-2和PAP2-1 對DPpH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力，對黃傘子實(shí)體多糖的體外抗氧化