銀耳遺傳轉(zhuǎn)化受體菌株篩選及其發(fā)酵條件研究.pdf

1、銀耳(Tremella fuciformis Berk)又稱白木耳，是一種食藥兼用的真菌，因其特殊的生活史，既可以人工栽培，又可以以酵母狀芽孢進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，因而它是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的理想材料。在利用其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因作物栽培和發(fā)酵之前首先要解決的問題就是模式受體菌株的篩選、銀耳芽孢菌株的栽培技術(shù)的建立、發(fā)酵技術(shù)及其遺傳背景的研究。為此，本文就從3個(gè)方面去研究：一是銀耳遺傳轉(zhuǎn)化受體菌株篩選；二是銀耳遺傳轉(zhuǎn)化受體菌株的發(fā)酵條件研究；三

2、是受體菌株銀耳交配型因子的初步研究。具體結(jié)果如下： 1、銀耳遺傳轉(zhuǎn)化受體菌株篩選 本實(shí)驗(yàn)從形態(tài)學(xué)、分子水平、對(duì)潮霉素的敏感程度以及生物量方面對(duì)19個(gè)測(cè)試菌株進(jìn)行篩選。結(jié)果從19個(gè)測(cè)試菌株中篩選到對(duì)潮霉素敏感且生長(zhǎng)速度最快的高產(chǎn)菌株T0040。再以T0040為出發(fā)菌株，通過出耳，彈射單擔(dān)孢子，獲取其可配對(duì)擔(dān)孢子，為以后遺傳背景的研究以及用于雙基因轉(zhuǎn)化的擔(dān)孢子的獲得提供可靠材料。為解決利用轉(zhuǎn)基因的芽孢進(jìn)行栽培試驗(yàn)可能面臨的出

3、耳難的問題，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件的研究，得到兩種可以誘導(dǎo)銀耳芽孢向菌絲萌發(fā)的培養(yǎng)基配方，分別是：配方二10％麩液、10％香灰菌木屑提取液、硫酸銨1.0g、麥芽糖10.0g、葡萄糖10.0g、瓊脂30.0g；配方三細(xì)米粉500.0g、麩皮500.0g、骨粉10.0g、過磷酸鈣10.0g、硫酸銨1.0g。 2、響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基 培養(yǎng)基的優(yōu)化是微生物培養(yǎng)中必須進(jìn)行的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。利用單因素實(shí)驗(yàn)分析碳源、氮源、礦質(zhì)元素、維生素

4、、生長(zhǎng)素五個(gè)單因子對(duì)芽孢生物量的影響，結(jié)果顯示5個(gè)因素對(duì)芽孢生物量的影響均達(dá)到顯著水平。根據(jù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇碳源葡萄糖、氮源蛋白胨，礦質(zhì)元素硫酸鎂，維生素VB1為實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的因子。利用響應(yīng)面的方法進(jìn)行尋優(yōu)，響應(yīng)面法可以在較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)中得到培養(yǎng)基組分的最佳搭配情況，從而降低實(shí)驗(yàn)成本。本文利用該法成功探索出篩選出的模式菌株T0040的發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖33.91g/L，蛋白胨8.29g/L，硫酸鎂2.81g/L，VB114.43mg/L，KH

5、2PO40.5g/L。 3、銀耳遺傳交配因子的初探 芽孢的配對(duì)實(shí)驗(yàn)得到3對(duì)可以配對(duì)出耳的擔(dān)孢子分別是：T1與T26、T1與T19、T4與T13。對(duì)銀耳的交配型因子從分子水平進(jìn)行了初步的探討，利用簡(jiǎn)并PCR的方法成功克隆了銀耳的線粒體間隔肽(MIP)基因。同時(shí)也嘗試了用簡(jiǎn)并PCR去克隆銀耳T0040的B交配型因子的STE3-like pheromone receptor片段，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行了結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)。這些工作