兩個(gè)玉米紋枯病病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子的克隆與功能鑒定.pdf

1、由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的玉米紋枯病是玉米生產(chǎn)上主要的真菌性病害之一，缺乏紋枯病主效抗病基因資源成為限制抗病品種培育和病害防治的主要因素之一。由于調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)也可以提高植物抗病性，豐富的抗病相關(guān)基因資源有望成為抗病分子育種的策略之一。利用病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗病相關(guān)基因的表達(dá)成為理想的手段，因而通過(guò)研究紋枯病病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子的功能，確定其誘導(dǎo)核心區(qū)段，可以為抗病基因工程提供在特異條件下表達(dá)

2、的載體平臺(tái)。此前實(shí)驗(yàn)室已通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分別對(duì)玉米紋枯病弱致病力菌株YWK-62和強(qiáng)致病力菌株YWK-196與玉米的互作在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究，并獲得了一系列差異表達(dá)基因。本研究對(duì)其中兩個(gè)差異表達(dá)量較大的紋枯病誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動(dòng)子PGRMZM2G127328和PGRMZM2G169240進(jìn)行了研究，驗(yàn)證相關(guān)啟動(dòng)子的功能，并探討鑒定其響應(yīng)玉米紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)的順式作用元件。
　　本研究分別克隆了GRMZM2G127328和GRMZM

3、2G169240翻譯起始位點(diǎn)上游約2 Kb的DNA片段，并連接在GUS報(bào)告基因的上游以構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化水稻品種中花11，分別獲得14株和10株轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PGRMZM2G127328和PGRMZM2G169240表現(xiàn)出豐富的組織表達(dá)模式并與玉米定量PCR檢測(cè)的結(jié)果相似。在接種紋枯病原YWK196后，兩個(gè)啟動(dòng)子24 h內(nèi)就能夠被高效誘導(dǎo)表達(dá)報(bào)告基因，從而驗(yàn)證了相關(guān)啟動(dòng)子受病原誘

4、導(dǎo)表達(dá)的能力。通過(guò)PLACE對(duì)兩個(gè)啟動(dòng)子序列的分析發(fā)現(xiàn)，它們除了含有基本的調(diào)控元件外，都存在大量的特異性表達(dá)調(diào)控元件，如激發(fā)子響應(yīng)元件等。對(duì)啟動(dòng)子PGRMZM2G127328的系列截短及煙草瞬時(shí)表達(dá)接種實(shí)驗(yàn)表明，-1416 bp至-1086 bp的缺失可以影響啟動(dòng)子受病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明在這一區(qū)段內(nèi)存在調(diào)控病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的順式作用元件。對(duì)照PLACE的分析結(jié)果，該區(qū)段含有三個(gè)GT-1元件，而GT-1(GAAAAA)在水稻等作物中被驗(yàn)證

5、是受病原菌和鹽脅迫誘導(dǎo)的作用元件。本實(shí)驗(yàn)室同期李寧同學(xué)的研究也證明GT-1可以響應(yīng)紋枯病菌YWK-196的誘導(dǎo)。將該區(qū)段內(nèi)的GT-1進(jìn)行缺失研究，其受紋枯病菌誘導(dǎo)的功能喪失，說(shuō)明GT-1為啟動(dòng)子PGRMZM2G127328的病原誘導(dǎo)核心元件。對(duì)啟動(dòng)子PGRMZM2G169240系列截短研究表明，-1278 bp至-1183 bp的缺失能夠影響該啟動(dòng)子受病原菌的誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明在這一區(qū)段內(nèi)存在正向調(diào)控病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的元件。對(duì)該區(qū)段的PLAC

6、E分析表明，這一區(qū)域內(nèi)未檢索到已知的病原誘導(dǎo)相關(guān)元件，說(shuō)明在這一區(qū)域內(nèi)可能存在新的病原調(diào)控調(diào)控元件。進(jìn)一步將截短片段分段連接35 S mini的實(shí)驗(yàn)表明，啟動(dòng)子-1263bp至-1234bp這30bp的區(qū)域內(nèi)存在一個(gè)受病原誘導(dǎo)的作用元件。綜上所述，本研究共驗(yàn)證了兩個(gè)玉米紋枯病菌病原誘導(dǎo)啟動(dòng)子的功能，確定了啟動(dòng)子PGRMZM2G127328的病原誘導(dǎo)核心元件為GT-1，而啟動(dòng)子PGRMZM2G169240中存在可以響應(yīng)紋枯病菌誘導(dǎo)的新調(diào)控