大豆胚珠特異性啟動子的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、AGL1基因?qū)儆贛ADS-box基因家族，MADS-box基因家族在植物花發(fā)育等許多方面起著重要的作用。因此，對于大豆來說，克隆大豆胚珠特異性表達(dá)的啟動子AGL1對研究大豆花發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制及分子育種具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 本文以“小黃豆”品種為材料，通過擬南芥CDS確定大豆的CDS，然后根據(jù)查找到的AGL1啟動子和內(nèi)含子序列設(shè)計引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將獲得的特異性序列連接到T載體，并進(jìn)行酶切鑒定，將鑒定得到的反向連

2、接的啟動子序列和正向、反向連接的內(nèi)含子序列進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，通過TA克隆法從大豆中克隆了約1568bp的大豆胚珠特異性表達(dá)的AGL1啟動子和3968bp的AGL1內(nèi)含子與網(wǎng)上公布的序列同源性是99％，說明所克隆的序列克隆成功。
　　 將通過TA克隆的反向AGL1啟動子序列用EcoR(I)和Pst(I)進(jìn)行雙酶切，同時對pCAMBIA1391Z載體也進(jìn)行EcoR(I)和Pst(I)雙酶切，然后把雙酶切后的反向AGL1啟動子序

3、列和雙酶切后的pCAMBIA1391Z載體進(jìn)行連接，命名為pBIA1391ZAGL1P。將反向AGL1內(nèi)含子序列和經(jīng)EcoR(I)和Nco(I)雙酶切后的pBIA1391ZAGL1P進(jìn)行連接，命名為pBIA1391ZAGL1PI。另外，內(nèi)含子對啟動子可能有調(diào)控作用，將通過TA克隆獲得的正反向內(nèi)含子序列和-49+pBIA1391Z載體進(jìn)行EcoR(I)和Nco(I)雙酶切后連接，并命名為pBI1391Z+（-49）-AGLI（正義連接）和

4、pBI1391Z+(-49)-AGLI（反義連接）。經(jīng)酶切鑒定，上述植物表達(dá)載體均構(gòu)建正確。
　　 表達(dá)載體構(gòu)建成功后，通過凍融法將植物表達(dá)載體pBIA1391ZAGL1P，pBIA1391ZAGL1PI轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。通過葉盤法將含有pBIA1391ZAGL1P和pBIA1391ZAGL1PI載體的農(nóng)桿菌EHA105侵染煙草無菌苗葉片，并且經(jīng)潮霉素篩選，獲得再生的抗性植株35棵，并對抗性植株進(jìn)行PCR分析，獲得轉(zhuǎn)基因