伯氏嗜線蟲致病桿菌蛋白酶抑制劑對豌豆蚜Acythosiphon pisunn Harris的殺蟲活性及其作用機制.pdf

1、蛋白酶抑制劑是一類能夠抑制蛋白水解酶活性的小分子蛋白質(zhì)，廣泛存在于微生物、植物和動物中。根據(jù)活性位點的氨基酸，蛋白酶抑制劑可以分成四類:絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑。在昆蟲腸道內(nèi)，蛋白酶抑制劑通過抑制蛋白酶的活性，可以干擾昆蟲的正常生長和發(fā)育。隨著近年轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，蛋白酶抑制劑在害蟲防治上的應(yīng)用前景越來越廣闊。伯氏嗜線蟲致病桿菌蛋白酶抑制劑Xbpi-1是從伯氏嗜線蟲致病桿菌（Xenor

2、habdusbovienii)中克隆、表達、純化的一種蛋白酶抑制劑，能明顯抑制煙蚜（Myzus persicae）和綠盲蝽（Lygus lucorum Meyer-Dur）的生長、發(fā)育和繁殖。
　　 為了探索Xbpi-1對豌豆蚜的殺蟲活性和機制，本文利用人工飼料摻入法測定了伯氏嗜線蟲致病桿菌蛋白酶抑制劑Xbpi-1對豌豆蚜生長和發(fā)育的影響;研究了Xbpi-1對豌豆蚜體內(nèi)主要蛋白酶活性及游離氨基酸水平的抑制作用;探討了Xbpi-1

3、在豌豆蚜體內(nèi)的分布及對組織學的影響。主要結(jié)果如下:
　　 1.采用飼喂法和浸漬法測定了蛋白酶抑制劑Xbpi-1對豌豆蚜存活、生長和發(fā)育的影響。結(jié)果表明，Xbpi-1對豌豆蚜具有較好的胃毒活性。取食含Xbpi-1濃度為50、200、400和800μg/mL人工飼料的豌豆蚜，96 h后的校正死亡率分別為2.1％、9.4％、19.7％和50.9％，蟲重分別減少12.3％、20.3％、25.7％和33.7％。但Xbpi-1對豌豆蚜不顯示

4、觸殺活性，利用浸漬法處理豌豆蚜24h和72h后，不同濃度(50-800μg/mL)Xbpi-1處理組的蚜蟲死亡率和對照組間均無顯著差異。
　　 2.為探討蛋白酶抑制劑Xbpi-1殺蟲活性的生化機制，測定了Xbpi-1對蟲體內(nèi)蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明，取食含Xbpi-1濃度為50、200、400和800μg/mL人工飼料的豌豆蚜96 h后，豌豆蚜體內(nèi)總蛋白酶較對照組活力分別降低13.1％、13.6％、23.2％和29.6％，均達

5、到顯著水平;處理組豌豆蚜體內(nèi)氨肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的活性也均有顯著降低。處理濃度為800μg/mL時，3種酶的活性分別降低了26.1％、23.5％和23.8％。
　　 3.Xbpi-1對蟲體內(nèi)游離氨基酸影響的分析結(jié)果表明，4個濃度處理組豌豆蚜體內(nèi)游離氨基酸的總量分別比對照降低了0.85％、13.50％、14.76％和20.81％，并且在處理濃度為800μg/mL時，15種游離氨基酸的含量顯著降低。因此，Xbpi-1的殺蟲

6、作用機制在于抑制了豌豆蚜體內(nèi)主要蛋白酶的活性，進而降低了游離氨基酸的含量。
　　 4.為了明確Xbpi-1在蟲體內(nèi)的分布及其組織學影響，構(gòu)建含Xbpi-1綠色熒光蛋白(GFP)的原核表達載體pET-Xbpi-GFP，并在大腸桿菌中進行大量表達和純化，獲得融合蛋白。將該融合蛋白摻入人工飼料中飼養(yǎng)豌豆蚜，然后進行組織切片并觀察。結(jié)果顯示，蚜蟲消化道和脂肪體組織均有綠色熒光，說明Xbpi-GFP除在消化道中外，還可以進入到血腔中發(fā)揮作