廣西巴馬小型豬α-1,3半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因過表達載體和RNAi載體的構(gòu)建及其沉默效率檢測.pdf

1、α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶(α-1，3－galactosyltransferase，α-1，3GT)基因又被稱為GGTA1基因，其編碼的α-1，3半乳糖轉(zhuǎn)移酶負責催化細胞表面Galα1－3Gal－β1－4GlcNAc-R結(jié)構(gòu)的糖表位，即α-Gal表位合成。由于人類在進化過程中GGTA1基因失活，α-Gal表位丟失，并相應(yīng)地產(chǎn)生了大量該表位的天然抗體，因此，α-13-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶是異種器官移植中產(chǎn)生超急性免疫排斥(hyperacute re

2、jection，HAR)的主要誘因。為探討應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默GGTA1基因的效率，本研究針對廣西巴馬小型豬α-1，3GT基因，設(shè)計并構(gòu)建了GGTA1基因過表達載體以及特異性RNAi干擾載體，并在細胞水平對其沉默效率進行檢測，為將來進一步獲得α-1，3GT基因沉默巴馬小型豬，構(gòu)建異種器官移植用巴馬小型豬模型奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗根據(jù)NCBI上發(fā)布的豬α-1，3GT基因cDNA序列設(shè)計引物，且在引物上下游分別加入HindⅢ與Ba

3、mHI兩個酶切位點。以廣西巴馬小型豬肝臟組織中的總RNA為模板，進行RT-PCR。產(chǎn)物經(jīng)純化，連接，轉(zhuǎn)化和擴增后測序。測序結(jié)果顯示分別成功克隆得到了廣西巴馬小型豬缺失第五外顯子(GGTA1-1，1080bp)的GGTA1基因cDNA序列及完整的GGTA1基因cDNA序列(GGTA1-2，1116bp)；將測序正確的陽性克隆質(zhì)粒pMD18-GGTA1-1、pMD18-GGTA1-2和pDsRed1-N1載體經(jīng)HindⅢ和BamHI雙酶切，

4、純化連接并構(gòu)建pDsRed1-GGTA1-1及pDsRed1-GGTA1-2重組真核表達載體；最后，利用脂質(zhì)體(Lipofectamine2000)介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入PK-15細胞中培養(yǎng)，經(jīng)轉(zhuǎn)染24h后，置于倒置顯微鏡下觀察其在細胞中的表達情況。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pDsRed1-GGTA1-1、pDsRed1-GGTA1-2的均能在PK-15細胞中表達，為下一步進行α-1，3GT基因的沉默實驗奠定基礎(chǔ)。
　　 為了篩選能有效抑制

5、GGTA1基因表達的小干擾RNA，本研究利用RNAi技術(shù)在PK-15細胞中沉默該基因，并對其沉默效率進行了檢測。首先，以pLLU2G載體為骨架，設(shè)計并構(gòu)建了pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2和pLLU2G-shGGTA1-3共3個針對巴馬小型豬GGTA1基因的RNAi載體及陰性對照載體pLLU2G－shGGTA1－control。載體通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PK－15細胞，以pDsRed1－GGTA1－1作為陽性

6、對照，lipofectamine2000與DMEM分別空轉(zhuǎn)作為空白對照。然后分別應(yīng)用熒光定量PCR(qRT－PCR)與Western blot對其進行沉默效率檢測。熒光定量PCR結(jié)果顯示，pLLU2G－shGGTA1－1、pLLU2G－shGGTA1－2和pLLU2G－shGGTA1－3抑制效率分別為85.02％、86.05％和83.85％。陰性對照pLLU2G－shGGTA1－Control、lipofectamine2000空白對照

7、組一與空轉(zhuǎn)染DMEM空白組二無抑制效果，陽性對照組pDsRed1－GGTA1－1高表達GGTA1基因。Western blot檢測結(jié)果表明，pLLU2G-shGGTA1-1、pLLU2G-shGGTA1-2和pLLU2G-shGGTA1-3這3個干擾實驗組GGTA1蛋白幾乎為痕量表達，這與熒光定量PCR檢測結(jié)果一致。陰性對照組pLLU2G-shGGTA1-Control、lipofectamine2000空白對照組一與空轉(zhuǎn)染DMEM空白