楊樹C4H基因RNAi載體和UGPase基因過量表達載體的構建及其遺傳轉化研究.pdf

1、木質素是維管植物次生細胞壁的主要成分，長期以來由于其降低牧草飼用品質，影響紙張和纖維生物質能源的生產而備受關注。木質素的數(shù)量和其反應活性一直是困擾紙漿生產的兩個重要的障礙。經過近20年來對苯丙氨酸代謝調控途徑的研究，目前木質素合成代謝過程中關鍵酶的研究比較清晰。肉桂酸 4-羥基化酶(C4H)是一類催化香豆酸 4’位置的羥基化并且依賴于NADPH的細胞色素P450單氧酶。RNAi技術是一種有效的在轉錄水平上降低目的基因表達的技術。本研究中

2、，構建C4H基因RNAi載體，通過轉基因技術抑制楊樹細胞內C4H基因的表達，獲得低木質素含量的楊樹轉基因植株。
　　 纖維素微纖絲參與到植物細胞壁的合成，也是制漿過程中所需要的成分。有關纖維素的合成了解的很少，相比較“酶促反應”，科學家更傾向于認為纖維素合成過程是“細胞生理反應過程”。目前有關纖維素合成的研究主要集中在纖維素合成酶(CesA)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶(UGPase)。有研究證明，過量表達UGPase基因可以顯著

3、增加植株的生物量和纖維素的含量。本研究中，通過構建UGPase過量表達載體，利用轉基因技術提高細胞中UGPase的含量，獲得高纖維素含量的楊樹轉基因植株。
　　 分別以南林95楊和南抗楊作為材料，構建了肉桂酸 4-羥化酶RNAi載體pBI121+2F和尿苷二磷酸葡糖糖焦磷酸酶過量表達載體pBI121+UGPase。開展了農桿菌介導的遺傳轉化，并對轉基因植株進行PCR檢測。獲得的主要結果如下：
　　 (1)利用RT-PCR

4、技術從南林95楊中克隆到432bp大小的C4H基因片段，并成功構建了C4H基因的RNAi載體。從南抗楊中克隆到楊樹全長的UGPase基因序列，全長共1410個堿基，編碼469個氨基酸，成功構建UGPase基因的過量表達載體。
　　 (2)通過生物信息學分析，UGPase預測的分子量為51.64KD，等電點為5.56。EST表達分析顯示該基因主要在花器官或其他頂端生長點組織表達。Pfam 軟件分析結果顯示該酶具有一個明顯的UDPG

5、P結構域，運用3D-JIGSAW軟件預測該酶的空間結構。UGPase家族進化分析顯示，雙子葉植物中該家族的保守性較單子葉植物低。
　　 (3)運用成功構建的UGPase過量表達載體進行農桿菌介導的楊樹遺傳轉化，最終獲得7株抗性苗，PCR初步確認其中有5株是轉UGPase基因植株。
　　 綜上所述，本研究成功從楊樹中克隆C4H基因的部分序列和UGPase基因的全長序列，成功構建了C4H基因的RNAi載體。運用多種生物信息學