楊樹C4H基因RNAi載體和UGPase基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、木質(zhì)素是維管植物次生細(xì)胞壁的主要成分，長期以來由于其降低牧草飼用品質(zhì)，影響紙張和纖維生物質(zhì)能源的生產(chǎn)而備受關(guān)注。木質(zhì)素的數(shù)量和其反應(yīng)活性一直是困擾紙漿生產(chǎn)的兩個重要的障礙。經(jīng)過近20年來對苯丙氨酸代謝調(diào)控途徑的研究，目前木質(zhì)素合成代謝過程中關(guān)鍵酶的研究比較清晰。肉桂酸 4-羥基化酶(C4H)是一類催化香豆酸 4’位置的羥基化并且依賴于NADPH的細(xì)胞色素P450單氧酶。RNAi技術(shù)是一種有效的在轉(zhuǎn)錄水平上降低目的基因表達(dá)的技術(shù)。本研究中

2、，構(gòu)建C4H基因RNAi載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)抑制楊樹細(xì)胞內(nèi)C4H基因的表達(dá)，獲得低木質(zhì)素含量的楊樹轉(zhuǎn)基因植株。
　　 纖維素微纖絲參與到植物細(xì)胞壁的合成，也是制漿過程中所需要的成分。有關(guān)纖維素的合成了解的很少，相比較“酶促反應(yīng)”，科學(xué)家更傾向于認(rèn)為纖維素合成過程是“細(xì)胞生理反應(yīng)過程”。目前有關(guān)纖維素合成的研究主要集中在纖維素合成酶(CesA)和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶(UGPase)。有研究證明，過量表達(dá)UGPase基因可以顯著

3、增加植株的生物量和纖維素的含量。本研究中，通過構(gòu)建UGPase過量表達(dá)載體，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高細(xì)胞中UGPase的含量，獲得高纖維素含量的楊樹轉(zhuǎn)基因植株。
　　 分別以南林95楊和南抗楊作為材料，構(gòu)建了肉桂酸 4-羥化酶RNAi載體pBI121+2F和尿苷二磷酸葡糖糖焦磷酸酶過量表達(dá)載體pBI121+UGPase。開展了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測。獲得的主要結(jié)果如下：
　　 (1)利用RT-PCR

4、技術(shù)從南林95楊中克隆到432bp大小的C4H基因片段，并成功構(gòu)建了C4H基因的RNAi載體。從南抗楊中克隆到楊樹全長的UGPase基因序列，全長共1410個堿基，編碼469個氨基酸，成功構(gòu)建UGPase基因的過量表達(dá)載體。
　　 (2)通過生物信息學(xué)分析，UGPase預(yù)測的分子量為51.64KD，等電點(diǎn)為5.56。EST表達(dá)分析顯示該基因主要在花器官或其他頂端生長點(diǎn)組織表達(dá)。Pfam 軟件分析結(jié)果顯示該酶具有一個明顯的UDPG

5、P結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用3D-JIGSAW軟件預(yù)測該酶的空間結(jié)構(gòu)。UGPase家族進(jìn)化分析顯示，雙子葉植物中該家族的保守性較單子葉植物低。
　　 (3)運(yùn)用成功構(gòu)建的UGPase過量表達(dá)載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化，最終獲得7株抗性苗，PCR初步確認(rèn)其中有5株是轉(zhuǎn)UGPase基因植株。
　　 綜上所述，本研究成功從楊樹中克隆C4H基因的部分序列和UGPase基因的全長序列，成功構(gòu)建了C4H基因的RNAi載體。運(yùn)用多種生物信息學(xué)