絨山羊毛囊體外培養(yǎng)及雌二醇對(duì)毛囊Bcl-2、Bax表達(dá)的影響.pdf

1、絨山羊毛囊是羊毛、羊絨的發(fā)生器官，羊絨品質(zhì)主要由其控制，因此研究影響毛囊生長(zhǎng)的因素及調(diào)控其生長(zhǎng)衰退的機(jī)理對(duì)于研究毛囊的發(fā)育和毛發(fā)的生長(zhǎng)有著巨大的意義。由于體內(nèi)影響毛囊生長(zhǎng)的因素眾多，不利于單一因素對(duì)毛囊生長(zhǎng)的研究，因此建立體外游離毛囊培養(yǎng)模型，以盡量避免體內(nèi)復(fù)雜因素的影響。尋找游離絨山羊毛囊培養(yǎng)的最佳條件，通過對(duì)毛囊細(xì)胞生物學(xué)的研究，探討毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制和影響毛囊生長(zhǎng)的因素。 針對(duì)以上相關(guān)問題，本論文以絨山羊毛囊體外培養(yǎng)為

2、基礎(chǔ)，并比較了不同培養(yǎng)基對(duì)毛囊培養(yǎng)的影響；利用組織法和消化法進(jìn)行了毛乳頭細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代和凍存；通過對(duì)游離絨山羊初級(jí)毛囊和綿羊毛囊的培養(yǎng)，觀察不同毛囊各生長(zhǎng)階段的組織結(jié)構(gòu)特征；應(yīng)用絨山羊毛囊體外培養(yǎng)模型研究雌激素對(duì)體外絨山羊初級(jí)毛囊生物學(xué)特性的影響；又進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平，利用體外培養(yǎng)的絨山羊皮片研究雌激素對(duì)Bcl—2、Bax基因表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)結(jié)果如下： 1．對(duì)傳統(tǒng)分離方法進(jìn)行改進(jìn)，參照Philpott[55]的

3、方法，通過顯微解剖法和切割法的結(jié)合，將絨山羊皮膚剪成大約（3～5） mm×10mm大小的皮片（只含單層毛囊），當(dāng)毛囊寬度適宜時(shí)可以獲得更多的游離毛囊，應(yīng)選用外毛根鞘完整、毛乳頭形態(tài)圓潤(rùn)光滑的生長(zhǎng)期毛囊進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)為了便于觀察和測(cè)量以及毛囊的生長(zhǎng)，我們認(rèn)為分離后的毛囊長(zhǎng)度約為2～3mm時(shí)最適合毛囊的生長(zhǎng)和觀察。 2．成功進(jìn)行了游離毛囊的體外培養(yǎng)，并發(fā)現(xiàn)初級(jí)毛囊在含血清DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度緩慢，扭曲變形早，平均在4天左右開始貼

4、壁；而使用無血清DMEM培養(yǎng)基初級(jí)毛囊生長(zhǎng)天數(shù)明顯延長(zhǎng)，毛囊的層次結(jié)構(gòu)及形態(tài)可長(zhǎng)時(shí)間保持不變，但從第2天開始生長(zhǎng)速度與含血清培養(yǎng)時(shí)無明顯差異（P>0．05）；使用Williams E無血清培養(yǎng)基初級(jí)毛囊在前5天生長(zhǎng)速度明顯加快，而初級(jí)毛囊在Williams E無血清無轉(zhuǎn)鐵蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度較Williams E無血清培養(yǎng)的慢，但毛囊存活時(shí)間與在Williams E無血清培養(yǎng)基中的無明顯差別（P>0．05），說明轉(zhuǎn)鐵蛋白有助于毛囊的生長(zhǎng)

5、和形態(tài)的維持。實(shí)驗(yàn)證明Williams E無血清培養(yǎng)更適合于絨山羊毛囊的體外培養(yǎng)。 3．利用Williams E無血清培養(yǎng)基對(duì)絨山羊次級(jí)毛囊進(jìn)行培養(yǎng)，前3天的平均生長(zhǎng)速度為0．031mm/d，接近于絨山羊體內(nèi)絨毛同期生長(zhǎng)的平均情況（0．056mm/d），但次級(jí)毛囊的生長(zhǎng)時(shí)間有限．維持時(shí)間短。 4．對(duì)不同時(shí)期初級(jí)毛囊進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11月份的初級(jí)毛囊前3天的平均生長(zhǎng)速度為0．08mm/d，與體內(nèi)初級(jí)毛囊同期的平均生長(zhǎng)

6、情況相同（0．08mm/d），且體外培養(yǎng)單天生長(zhǎng)速度最大值（0．09mm/d）大于體內(nèi)單天生長(zhǎng)速度的最大值（0．087mm/d）。生長(zhǎng)情況好于體外9月份的生長(zhǎng)情況，與初級(jí)毛囊在體內(nèi)的活性在9月份達(dá)到最高峰相反，由此可以推斷毛囊的活性與溫度密切相關(guān)。 5．利用膠原酶消化和機(jī)械分離相結(jié)合的方法分離處于生長(zhǎng)期的內(nèi)蒙古絨山羊初級(jí)毛囊毛乳頭細(xì)胞，并成功培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下毛乳頭細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，具有多層凝集特性。 6．對(duì)體外游

7、離山羊初級(jí)毛囊與綿羊毛囊的生長(zhǎng)進(jìn)行比較。在培養(yǎng)過程中，綿羊毛囊的日平均生長(zhǎng)速度明顯高于絨山羊毛囊的生長(zhǎng)速度，但各自在前3天的生長(zhǎng)均能保持相對(duì)穩(wěn)定的水平，并與體內(nèi)毛囊的生長(zhǎng)速度接近。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，綿羊毛囊的生長(zhǎng)速度急劇下降，而絨山羊初級(jí)毛囊在前9天的生長(zhǎng)情況始終較為穩(wěn)定，毛囊形態(tài)變化較規(guī)律。表明：選擇31℃、Williams E無血清培養(yǎng)基進(jìn)行絨山羊初級(jí)毛囊和綿羊毛囊培養(yǎng)有利于毛囊的生長(zhǎng)。 7．17—β—雌二醇對(duì)絨山羊初級(jí)毛

8、囊的生長(zhǎng)沒有促進(jìn)作用。0．1nmol/L組與對(duì)照組生長(zhǎng)速度無明顯差異（P>0．05），這可能與此濃度與體內(nèi)雌二醇生理濃度（0．05～0．19nmol/L[244]）基本相同，且毛囊生長(zhǎng)速度略好與對(duì)照組，在前10d基本保持在一個(gè)相對(duì)較快的水平上，在培養(yǎng)后期部分毛囊會(huì)出現(xiàn)下段彎曲。隨著17—β—雌二醇濃度的增加毛囊的生長(zhǎng)受到抑制，100nmol/L組對(duì)毛囊的生長(zhǎng)明顯抑制（P<0．01），大部分毛囊在培養(yǎng)第9d左右停止生長(zhǎng)進(jìn)入退行期。

9、 8．體外培養(yǎng)24h的山羊皮片，分別添加不同濃度的17—β—雌二醇，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h后運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)凋亡調(diào)控基因Bcl—2、Bax表達(dá)情況。結(jié)果顯示：添加了雌二醇的各組毛囊Bcl—2mRNA表達(dá)量隨濃度的增加而逐漸減少，說明在雌二醇的作用下，體外培養(yǎng)毛囊的Bcl—2mRNA表達(dá)顯著下降。而Bax mRNA表達(dá)量各組均表現(xiàn)出先增加后逐漸下降的趨勢(shì)。雌二醇能夠降低Bcl—2/Bax mRNA比率，