2013年--外文翻譯--白藜蘆醇磺丁基醚-β-環(huán)糊精包合物的表征和體外抗腫瘤活性（譯文）

1、<p><b>　　中文4250字</b></p><p>　　出處：Venuti V, Cannavà C, Cristiano M C, et al. A characterization study of resveratrol/sulfobutyl ether-β-cyclodextrin inclusion complex and in vitro antica

2、ncer activity.[J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2013, 115C(115C):22-28.</p><p>　　白藜蘆醇/磺丁基醚-β-環(huán)糊精包合物的表征和體外抗腫瘤活性</p><p>　　Venuti V, Cannavà C, Cristiano M C</p><p>　　

3、學(xué)者最近的研究熱點是RSV的天然或改性環(huán)糊精的包合物，他們報導(dǎo)，藥物的水溶性和抗氧化活性增加，尤其當(dāng)它與HP-β-CD包合。據(jù)我們所知RSV與SBE-β-CD包合研究較少，也沒有包合物的表征研究。</p><p>　　在本試驗中，我們制備RSV/SBE-β-CD包合物，環(huán)糊精對藥物水溶性的影響進(jìn)行評價。通過冷凍干燥方法制備固體包合物，并用傅里葉變換紅外光譜衰減全反射（FTIR-ATR）幾何圖譜表征了固體狀態(tài)包合物

4、的特點。在溶液中，相溶解度研究和工作曲線法考察包合物的化學(xué)計量。人乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7）的體外生物測定法評估SBE-β-CD對RSV抗癌活性的影響。</p><p>　　2.2 包合物的制備</p><p>　　SBE-β-CD（200mg）溶解在10ml常溫水并加入超過其固有溶解度量的RSV。為了防止RSV從反至順位轉(zhuǎn)化，燒杯經(jīng)過光處理，然后超聲水浴30min，再攪拌3天。然后通過0

5、.22 m聚四氟乙烯過濾器過濾并凍干。</p><p>　　2.3 相溶解度分析</p><p>　　過量RSV加入含有緩沖溶液的SBE-β-CD（0–8×10?3M）中，水浴15min，密封，避免發(fā)生蒸發(fā)，在25±0.1?C磁力攪拌3天達(dá)到平衡，懸浮液通過0.22 m聚四氟乙烯的過濾器過濾并通過紫外–可見光譜在200–400 nm范圍分析。這樣做的目的是評估RSV的溶

6、解量。所有的測量至少重復(fù)三次。獲得的數(shù)據(jù)可確定RSV與SBE-β-CD結(jié)合常數(shù)。在試驗條件下沒有觀察到RSV降解。</p><p>　　2.4 工作曲線圖法</p><p>　　RSV和SBE-β-CD的等摩爾（1×10?5M）甲醇/水溶液（55 / 45，v/v）混合固定體積的摩爾比從0.1到0.9變化，保持恒定的總摩爾濃度。攪拌1h后，用紫外–可見光譜在305 nm且abs為

7、各溶液的吸光度的變化值。然后，abs×[ RSV ]對R（R = [RSV] / [RSV] + [ SBE-β-CD ]）繪圖。</p><p>　　2.5 水溶性和溶出度測定</p><p>　　在3ml水中懸浮過量的游離的RSV與RSV / SBE -β-CD包合物，25±0.1?C攪拌2天測定各樣品水溶性。懸浮液通過0.22 m聚四氟乙烯的過濾器過濾且用紫外-可

8、見光譜在305 nm分析。對同一樣品的溶出率的測定是根據(jù)美國藥典第三十二槳法進(jìn)行。330mg游離RSV或?qū)?yīng)量包合物懸浮在900ml水中，在37±0.5?C. 轉(zhuǎn)速100 rpm下，固定的時間間隔測定采用紫外可見光譜在305 nm測定RSV溶液的濃度。用新鮮水補液，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。</p><p><b>　　2.6。紅外光譜</b></p><p>　　

9、在室溫下使用傅里葉變換紅外（FTIR）光譜儀和熱電冷卻氘化硫酸（DTGS）探測器，對紅外光譜進(jìn)行了研究?；谒p全反射（ATR）技術(shù)該粉末被包含在ATR系統(tǒng)，。ATR設(shè)置具有各種優(yōu)點，相對于普通的吸收裝置。它是無損的，它只需要微量的樣品，光譜圖顯示良好的信號-噪聲比，容易避免光譜帶飽和。此外，化學(xué)分析可以直接在ATR光譜進(jìn)行，避免了計算使用的光學(xué)常數(shù)的必要性。光譜記錄在3800–600cm ?1光譜范圍。為了避免污染，光譜在干燥空氣中收

10、集，與分辨率為4cm?1，平均100重復(fù)掃描，從而保證良好的信噪比和高重現(xiàn)性。</p><p><b>　　2.7 細(xì)胞培養(yǎng)</b></p><p>　　MCF-7細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)皿（100mm×20mm）使用含有谷氨酸，青霉素（100 IU /ml），鏈霉素（100g/ml）和牛血清（10%，v/v）的細(xì)胞培養(yǎng)基在5% CO2，37?C下孵育，80%融合

11、度時，加入胰蛋白酶（1ml），1-2min后，等細(xì)胞都變圓后加入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吸到10ml或15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5min，倒掉上清液，用培養(yǎng)基再懸浮，使最終濃度約為7.6×103 cells/cm2。</p><p>　　2.8。細(xì)胞毒性活性評價</p><p>　　MTT法進(jìn)行RSV，SBE-β-CD與RSV–SBE-β-CD包合物對細(xì)胞毒

12、活性測定，檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臢（Z?。‵ormazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，甲臢晶體的濃度對細(xì)胞的活性直接相關(guān)。MCF-7細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（5×103 / 0.66 cm2），分別在37?C.培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.1ml/孔的不同的樣品；未經(jīng)處理的細(xì)胞為對照?；衔镌诓煌姆跤龝r間（24，48，和72小時）的細(xì)胞毒性活性進(jìn)行

13、了評價。每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100ul DMSO /乙醇（1:1，V/V）溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，溶解后的甲臢晶體用微孔板分光光度計在570 nm波長(690nm校準(zhǔn))測量吸光度。</p><p>　　細(xì)胞存活率的百分比計算根據(jù)以下方程：</p><

14、;p>　　細(xì)胞存活率（%）=AbsT /AbsC × 100AbsT為處理細(xì)胞吸收度值，AbsC是對照（未處理）細(xì)胞吸光度值。。</p><p><b>　　2.9。統(tǒng)計分析</b></p><p>　　進(jìn)行單因素方差分析，以評估統(tǒng)計意義，P＜0.05的值被認(rèn)為差異顯著。</p><p><b>　　結(jié)果</b

15、></p><p>　　3.1溶液中包合物的表征</p><p>　　在實驗條件下，排除RSV降解，藥物的水溶液分別存儲在25±0.1?C，在黑暗條件下，在越來越多SBE-β-CD存在的情況下（RSV：SBE-β-CD摩爾比1:1，1:10，1:50和1:100），紫外-可見光譜觀察結(jié)果。反式RSV顯示了兩個紫外波段，一個集中在215 nm附近，另一個在300 nm左右。后

16、者的光帶在305和316nm處有兩個小峰。從反式轉(zhuǎn)換為順式RSV 后，300 nm譜帶消失，出現(xiàn)在285 nm波段。環(huán)糊精加入后沒有觀察到紫外–可見光譜的變化，顯示在實驗條件下RSV沒有從反式轉(zhuǎn)換為順式（光譜不顯示）。但是越來越多SBE-β-CD的加入，兩條RSV的吸收強度發(fā)生變化。主要的影響是在兩個紫外波段：（i）摩爾比小于或等于1:50的，在300 nm左右的吸收帶呈現(xiàn)減色效應(yīng)，在1:100摩爾比時呈現(xiàn)增色效應(yīng)；（ii）1：1，1:

17、10的摩爾比在215 nm有輕微的增色效應(yīng)；環(huán)糊精濃度較高時，峰幾乎消失（1:50和1:100）。在215nm邊緣，在所有考察的濃度均紅移約3nm。在紫外–可見光譜呈現(xiàn)變化是由于藥物與輔料，通常伴隨著靜電作用的建立，范德華力和/或氫鍵類型的相互作用。在我</p><p>　　評價環(huán)糊精包合化學(xué)分子能力最常見的方法是相溶解度研究。圖3a溶解度圖顯示SBE-β-CD與RSV包合，使藥物溶解度以濃度依賴的方式增加，顯示

18、出良好的主體/客體相互作用。特別是，制得AL型圖，因為圖的斜率小于1，包合物的化學(xué)計量比假設(shè)為1:1在研究的濃度范圍內(nèi)。相溶解度圖從直線部分計算穩(wěn)定常數(shù)Kc，Kc值是10114M?1。</p><p>　　包合物的化學(xué)計量是通過工作曲線證實，結(jié)合存在SBE-β-CD時RSV在300 nm波段區(qū)域紫外可見光譜的變化，最大值在R = 0.5且曲線呈現(xiàn)高度對稱的形狀，證明研究的濃度范圍內(nèi)化學(xué)計量比為1:1時包合物存在，

19、在（圖4）。這些結(jié)果與相溶解度研究一致。</p><p>　　包合物強烈增加RSV的水溶性（在25?C時，未包合RSV與RSV–SBE-β-CD包合物分別為0.03mg/ml和～1.1mg/ml）且呈現(xiàn)出非?？焖俚娜艹觯▓D3b）。</p><p>　　3.2 固態(tài)包合物的表征</p><p>　　FTIR-ATR技術(shù)通過分析個別組分和物理混合物在振動特征的顯著變化，

20、被應(yīng)用為檢測固相包合物的形成以及指出主客體不同分子及官能團(tuán)。</p><p>　　RSV，SBE-β-CD，RSV + SBE-β-CD 1:1物理混合物，1:1的包合物的FTIR-ATR光譜是如圖5所示。</p><p>　　RSV的紅外光譜顯示以下主要峰：3214cm?1，游離的O-H伸縮振動，在1600和1587cm?1雙波峰，對應(yīng)芳香苯環(huán)C=C雙鍵和c-c烯烴伸縮振動。再次，在15

21、13和1463cm?1反映苯環(huán)骨架振動峰。在988和965cm?1峰歸因于不飽和烴基=C-H彎曲振動。SBE-β-CD的主要特征是在3700–3000cm?1 O-H強烈伸縮振動，在3000–2800cm?1區(qū)出現(xiàn)-CH、-CH2-基團(tuán)重疊的伸縮振動,在1148和1016cm?1吸收峰分別為C-H和C-O伸縮振動。</p><p>　　物理混合物的紅外光譜包含了所有的來自RSV和SBE-β-CD的特征峰，沒有表現(xiàn)

22、出任何顯著差異。這表明，藥物仍然是完整的，藥物和環(huán)糊精之間無交互作用。相反的，與物理混合物相比，該包合物具有的相關(guān)基團(tuán)的光譜、強度和特征吸收峰的寬度均發(fā)生變化，顯示RSV和SBE-β-CD之間的新化學(xué)鍵的形成。</p><p>　　通過觀察高頻區(qū)域的光譜，關(guān)于“主-客”的相互作用驅(qū)使包合的主要機(jī)制信息已被收集。</p><p>　　以往的研究表明，曲線擬合技術(shù)可應(yīng)用于紅外O H伸縮振動波段

23、，為了定量證明藥物與環(huán)糊精包合后包合物的O-H變化，O-H伸縮振動分別是由若干未結(jié)合的RSV，SBE-β-CD組件對應(yīng)OH基團(tuán)，水分子內(nèi)或分子間氫鍵，本文做定量研究。由于O-H和C-H伸縮振動帶部分重疊，第一塊從3700到3000cm?1，第二塊是3000～2800cm?1，所以我們最初進(jìn)行擬合的整個范圍，采用Voigt處理方式，然后我們從總減去來自于甲基的對稱和反對稱伸縮振動。最后，擬合一個僅適用于O H伸縮振動區(qū)域更詳細(xì)的曲線。二階

24、導(dǎo)數(shù)計算數(shù)量和波數(shù)得到RSV+SBE-β-CD1:1物理混合物和RSV/SBE-β-CD1:1的包合物，分別見圖6A和B，五子帶進(jìn)行區(qū)分。相應(yīng)的峰值波長和百分比強度報告在表1中。 </p><p>　　這種光譜變化表明包合后氫鍵重排。通過看O-H在特定處理中占的百分比強度，我們可以假設(shè)這個系統(tǒng)的包合機(jī)理。根據(jù)這一機(jī)制，客體進(jìn)入主體時會導(dǎo)致，一方面，主體腔內(nèi)的水分子部分逃脫（反映在I1下降），這將使環(huán)糊精整體重新分

25、配。另一方面，氫鍵的改變，特別是，所觀察到I4的增加，通過對物理混合物與包合物RSV的O H基的核算，證明了包合作用建立在把RSV的分子內(nèi)氫鍵斷裂基礎(chǔ)上，且在高波數(shù)階段子峰發(fā)生遷移變化，也說明包合過程與O-H的變化有很大相關(guān)性。、</p><p>　　在C-H伸縮振動也檢測到明顯的變化，（見圖5）。環(huán)糊精在2940cm?1和2889 cm?1，兩峰處，物理混合物依稀可辨，包合物完全重疊，提示在主–客體相互作用使也

26、伴隨著C-H的參與。</p><p>　　最后，我們還觀察到在環(huán)糊精 1644 cm?1強烈的波段，在從物理混合物包含復(fù)雜，歸因于附著在環(huán)糊精腔的水分子彎曲振動，這可以證明包合后一部分水分子鍵與環(huán)糊精發(fā)生斷裂，氫鍵重排，更多成為分子間氫鍵，與已被O-H伸縮振動區(qū)的分析顯示協(xié)議。</p><p>　　總之，物理混合物與包合物顯示出明顯的光譜吸收差異。</p><p>

27、<b>　　3.3體外生物測定</b></p><p>　　由于RSV顯示重要的預(yù)防癌癥活性，采用細(xì)胞活性MTT試驗探究RSV和RSV包合物的體外癌細(xì)胞毒性。RSV水溶性差，所以為混懸劑，包合物與環(huán)糊精為溶液進(jìn)行實驗。</p><p>　　正如預(yù)期的那樣，環(huán)糊精體外抗癌活性無顯著優(yōu)勢。</p><p>　　在試驗時間，可以觀察到RSV與RSV包

28、合物組MCF-7存活率明確的降低（圖7）。然而RSV包合物和游離藥物在24小時抗腫瘤活性之間無顯著差異。相對于游離藥物，RSV包合物加入 48 h和72 h后，導(dǎo)致很大程度的細(xì)胞毒性?？拱┗钚缘母纳?，可能是兩個因素：（i）SBE-β-CD對RSV增溶作用的（ii）包合物的Kc值。事實上，只有溶解的RSV（不與環(huán)糊精包合的部分）能夠穿透活細(xì)胞，發(fā)揮其抗腫瘤活性。RSV的作用僅是其溶解性差的限制。另一方面，包合的RSV是完全溶解，并且對于R

29、SV表現(xiàn)出更大的抗癌活性。然而，這個抗癌活性沒有我們在對藥物的水溶性改善的基礎(chǔ)上預(yù)期的多，或許由于包合物的KC值高，大量的藥物與環(huán)糊精穩(wěn)定結(jié)合不能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而減少影響。</p><p><b>　　結(jié)論</b></p><p>　　相溶解度法、紫外可見光譜和紅外光譜–研究了包合物的形成</p><p>　　在溶液狀態(tài)中，以1:1形成的包合

30、物，觀察到化學(xué)計量比和高的穩(wěn)定性常數(shù)。包合作用對溶解度有改善，且高的溶解速率。</p><p>　　隨后，F(xiàn)TIR-ATR光譜表明包合物與物理混合物存在明顯差異，特別是，通過對O-H伸縮紅外波段的分解，成功監(jiān)測包合機(jī)制。</p><p>　　初步的體外生物學(xué)的研究結(jié)果表明，SBE-β-CD改善RSV對MCF-7細(xì)胞株的抗腫瘤活性。這項研究表明，SBE-β-CD很好的潛在價值是在RSV的口腔