非甾體類抗炎藥對胃癌細胞株BGC-823COX-2、錯配修復酶hMLH1和hMSH2蛋白表達的影響.pdf

1、目的：在我國，胃癌是嚴重威脅人民生命健康的疾病。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，錯配修復酶(Mismatchrepairenzyme，MMR)表達缺失與腫瘤發(fā)生關系密切。MMR是DNA修復系統(tǒng)中重要的工具酶，其功能主要是修復錯誤配對的堿基。MRR超家族有9種錯配修復酶，其中以人類mut-s同系物1(humanmut-lhomologue1，hMLH1)和人類mut-s同系物2(humanmut-shomologue2，hMSH2)功能最重要，二者在很多腫瘤中

2、出現(xiàn)表達缺失或降低。當MRR表達缺失或降低時常出現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定(Microsatelliteinstability,MSI)，MSI可使整個基因組穩(wěn)定性下降，隨機突變率增高，導致一系列腫瘤相關靶基因改變，引起腫瘤的發(fā)生。 環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)是合成前列腺素的限速酶，正常組織不表達，但在消化道腫瘤中常為陽性表達，可促進腫瘤的發(fā)生。有研究表明，COX-2表達上調或活性增加與胃癌形成有關。P38

3、絲裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activatedproteinkinase，P38MAPK)通路是發(fā)現(xiàn)的一類新的MAPK信號轉導通路，P38MAPK表達和活性的變化可有效調節(jié)該信號通路，通過不同的靶基因轉導凋亡信號，從而介導細胞的凋亡，參與對COX-2的調控，介導腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。 非甾體類抗炎藥(non-steroidalanti-inflammatorydrugs,NSAIDs)對許多惡性腫瘤具有抑制作用。存在M

4、SI、錯配修復酶缺乏的胃癌細胞株經sulindac(COX-2選擇性抑制劑)處理后，MSI表型減少，提示NSAIDs可通過減少MSI，發(fā)揮抗腫瘤作用。 本研究采用流式細胞術、免疫細胞化學染色、Westernblot等方法研究分析，非甾體類抗炎藥對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞株COX-2、hMLH1、hMSH2蛋白表達的影響，以期探討NSAIDs的作用機制及COX-2、hMLH1、hMSH2與胃癌發(fā)生的關系。 材料與方法1材料CO

5、X-2高表達人胃腺癌細胞株BGC-823，COX-2選擇性抑制劑：celecoxib；COX-2非選擇性抑制劑：aspirin。 2方法2.1甲基偶氮唑藍(MTT)法測定各組BGC-823細胞株的增殖情況，以確定半數抑制濃度(IC50)。 2.1.1正常對照組、溶劑對照組、藥物實驗組；藥物濃度：aspirin100μmol.L-1、200μmol.L-1、400μmol.L-1、800μmol.L-1；celecoxib

6、20μmol.L-1、40μmol.L-1、80μmol.L-1、160μmol.L-1。 2.1.2分別于藥物作用72h后測定IOD值，計算細胞生長抑制率，根據IC50=Lg-1[Xm-I(∑p-0.5)]，確定IC50(aspirin400μmol.L-1，celecoxib80μmol.L-1)。 2.2分別選取兩種藥物的三個不同濃度，aspirin：100μmol.L-1、200μmol.L-1、400μmol.

7、L-1；celecoxib：20μmol.L-1、40μmol.L-1、80μmol.L-1作用于BGC-823細胞株72h，收集細胞。 2.3選取aspirinIC50、celecoxibIC50濃度的藥物作用于BGC-823細胞24h、48h、72h收集細胞。 2.4檢測指標：2.4.1流式細胞定量檢測技術(FCM)檢測藥物作用72h細胞凋亡率的變化。 2.4.2瓊脂糖凝膠電泳(DNALadder)檢測藥物作

8、用72h細胞BGC-823細胞凋亡情況。 2.4.3免疫細胞化學法(SP法)觀察藥物作用72h細胞hMLH1、hMSH2、COX-2蛋白表達情況的變化。 2.4.4蛋白免疫印跡(WesternBlot)檢測藥物作用24h、48h、72h細胞hMLH1、hMSH2、COX-2蛋白的表達情況。 2.4.5流式細胞定量檢測技術(FCM)檢測藥物作用24h、48h、72h，細胞周期及hMLH1、hMSH2、COX-2、p

9、38蛋白表達的變化。 結果1Aspirin、celecoxib對BGC-823細胞株增殖的影響NSAIDs可抑制BGC-823細胞增殖，溶劑對照組與空白對照組細胞未見明顯變化。(P＞0.05，Table1)。aspirinIC50為400μmol.L-1，celecoxibIC50為80μmol.L-1。 2對BGC-823細胞凋亡的影響：2.1藥物實驗組BGC-823細胞DNA直方圖二倍體峰前均可見凋亡細胞特征性的亞二

10、倍體峰(Fig.1-3)，對照組未見凋亡峰。celecoxib組凋亡率(31.50±8.91％)明顯高于aspirin組凋亡率(20.20±6.72％)和對照組(P＜0.05)。提示NSAIDs可促進胃癌細胞株凋亡，celecoxib在相同條件下誘發(fā)BGC-823細胞凋亡，效果強于aspirin。 2.2DNALadder的檢測DNA裂解片段分析，結果顯示(Fig.4):aspirin400μmol.L-1、celecoxib8

11、0μmol.L-1作用于BGC-823細胞株，DNA裂解，瓊脂糖凝膠電泳后，上樣孔下方出現(xiàn)較清晰明亮的DNA梯狀條帶?？瞻讓φ战M、celecoxib20μmol.L-1、aspirin100μmol.L-1未見DNA梯帶；celecoxib40μmol.L-1、aspirin200μmol.L-1有DNA“涂抹”(smear)現(xiàn)象，并隱約可見模糊的DNA梯狀帶。DNA梯狀分布圖形顯示DNA結構呈有序斷裂，BGC-823細胞凋亡，從DNA

12、分子水平證實aspirin、celecoxib作用的BGC-823細胞出現(xiàn)凋亡。 3免疫細胞化學染色COX-2、hMLH1及hMSH2三者均為核著色，(Fig.6-14)光鏡下觀察，aspirin、celecoxib作用后，COX-2蛋白表達與對照組比較均降低，hMLH1蛋白及hMSH2蛋白表達均增多。celecoxib作用強于aspirin。 4WesternBlot檢測COX-2、hMLH1、hMSH2蛋白表達COX

13、-2蛋白分子量為72kD，Western雜交后在72kD位置出現(xiàn)陽性條帶，hMLH1蛋白分子量為85kD，Western雜交后在85kD位置出現(xiàn)陽性條帶，hMSH2蛋白分子量為110kD，Western雜交后在110kD位置出現(xiàn)陽性條帶。隨著NSAIDs作用時間延長COX-2蛋白表達量逐漸減少，hMLH1、hMSH2蛋白表達量逐漸增高，且不同作用時間細胞的蛋白表達量均有差異(P＜0.05，F(xiàn)ig.15-17)。)。celecoxib組作

14、用強于aspirin組，兩者與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05)。 5NSAIDs對體外培養(yǎng)BGC-823細胞周期的影響。隨著aspirin、celecoxib藥物濃度的增加，BGC-823細胞在細胞周期中的分布發(fā)生變化，G0/G1期細胞數逐漸增加，S期和G2/M期細胞數逐漸減少。藥物組與asprin組及對照組比較有顯著性差異(P＜0.05，table2)。隨著藥物作用時間的延長，G0/G1期細胞數逐漸增加，S期和G2/

15、M期細胞數逐漸減少。celecoxib組作用強于aspirin組，兩者與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05，table3)。由此可見，aspirin、celecoxib可以將BGC-823細胞阻滯于G0/G1期，且有明顯的量效和時效關系。 6COX-2、hMLH1、hMSH2、和p38蛋白檢測隨著藥物濃度的增加，COX-2蛋白表達明顯減少，hMLH1、hMSH2蛋白表達逐漸增加。隨著作用時間的延長，COX-2蛋白表達逐漸減

16、少，hMLH1、hMSH2、p38蛋白表達逐漸增加。celecoxib組作用強于aspirin組，兩者與對照組比較，均有顯著性差異(P＜0.05，table4-5)。由此可見，aspirin、celecoxib可以影響COX-2、hMLH1、hMSH2、p38蛋白的表達量，且有明顯的量效和時效關系。 結論1非甾體類抗炎藥的作用：(1)抑制BGC-823細胞的增殖，誘導BGC-823細胞凋亡。(2)延長細胞周期。(3)下調COX-