光甘草定提純研究[文獻(xiàn)綜述]

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p><b>　　光甘草定提純研究</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　甘草為豆科植物甘草(Glycyrr

2、hiza uralensis Fisch)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L)的干燥根及根莖，是一種常用的重要中藥[1]。甘草中的活性成分主要包括3類：三萜類(以甘草甜素為主)、黃酮類和多糖類。甘草黃酮類成分(1icorice flavonoids)具有多種生理功能，如抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡等[2]。光甘草定( Glabridin ,圖

3、1)是光果甘草所特有的異黃酮類成分，它不僅在光果甘草黃酮類成分中含量最高(占11％)，而且具有良好的藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值。作為光果甘草中的主要脂溶性異黃酮，光甘草定主要留存在提取甘草水溶性成分后留下的甘草廢渣中。在藥理實(shí)驗(yàn)中，光甘草定顯示出明顯的抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用及一定的降血脂和降血壓等作用[3-4]，在心腦血管疾病的防治藥物研究中亦顯示出良好的前景。</p><p>　　圖1　光甘草定的化學(xué)結(jié)構(gòu)式</p&g

4、t;<p>　　2 光甘草定的結(jié)構(gòu)性質(zhì)</p><p>　　光甘草定(glabridin)微黃色粉末，mp.233.3～235.5℃, [α]19＋9.5°(c0.3,CHCl3);與FeCl3反應(yīng)顯棕色。TLC:Rf = 0.42(展開(kāi)劑CH2Cl29%/MeOH, Silica gel 60 F254)。UVλmax(EtOH)nm:230,282,322(sh)。EI-MS m/z(

5、rel. int.,% ):324(M+,31) , 309(M+-CH3,100),187(14),</p><p>　　173(52),136(8);分子式C20H20O4 ,計(jì)算值: C 74.06;H 6.21; 測(cè)定值:C 74.24; H 6.27。IRλmax (KBr)cm-1:3374,1620,1607,1596,1519。1H NMR ( 400MHz,CDCl3)δ:7.68 (1H, b

6、r s,OH),7.48, (1H,brs,OH),6.91 (1H,d,J = 8.2 Hz, 6′-H) 6.81 (1H,d,J = 8.2 Hz,5-H),6.64 (1H,d,J = 9.9 Hz,4″-H) 6.46 (1H,d,J = 2.2 Hz, 3′-H),6.39 (1H, d,J = 8.2Hz, 2.2,5′-H),6.33(1H,d,J = 8.2 Hz,6-H) , 5.55 (1H,d,J = 9

7、.9 Hz, 3″-H) , 4.39 (1H,dd,J = 1.8, 3.2,10.3 Hz, 2-H) ,4.01 (1H,ddd,J = 10.3,10.3 Hz,2-H) ,3.52 ( 1H,m,3-H) ,2.99(1H,dd,J = 11.0, 15.7</p><p>　　3 光甘草定的分離和提純</p><p>　　3.1 光果甘草總提取物的制備[6] </p>

8、;<p>　　取光果甘草50g，研碎，分別用丙酮提取3次，合并3次提取液，減壓蒸餾回收丙酮，得黃褐色浸膏2g(總提取物)，提取分離工藝見(jiàn)圖2。</p><p>　　3.2 柱層析法分離</p><p>　　3.2.1 Al2O3柱層析分離</p><p>　　將氧化鋁置于玻璃層析柱內(nèi)(2 cm×30 cm，上柱高度為15cm)甲醇浸泡24h

9、。將總提取物與少量Al2O3混合，加入 Al2O3層析柱后，采用濃度梯度法(分別用CH2Cl2、CH2Cl2／MeOH 2.5%、CH2C12／MeOH 5%、CH2Cl2／MeOH 10%、CH2Cl2／MeOH 40%)進(jìn)行洗脫。因Al2O3極性大而能吸附極性大的成分，而通過(guò)洗脫可得到極性小和極性中等的組分。因光甘草定的極性中等而留在極性中等的組分中(組分Ⅱ)。</p><p>　　3.2.2 硅膠柱層析分離

10、</p><p>　　將組分Ⅱ用硅膠層析柱進(jìn)行分離(2cm×20cm，上柱高度15cm)，分離成Ⅱ(A)、Ⅱ(B)和Ⅱ(C)3個(gè)組分；洗脫液濃度分別為：CH2Cl2、CH2Cl2／MeOH (100：2.5)、CH2Cl2／MeOH(20：1)、CH2Cl2／MeOH(10:1)、CH2Cl2／MeOH(5:2)。</p><p>　　3.3 制備型薄層板分離 </p>

11、;<p>　　將組分Ⅱ(C)用制備型薄層板進(jìn)行進(jìn)一步分離(CH2C12／MeOH 9%)，收集Rf值為0.42的色帶，并用丙酮提取，減壓蒸干。用苯／環(huán)己烷混合溶劑重結(jié)晶，得光甘草定純品。分離過(guò)程中，光甘草定用簡(jiǎn)單的TLC法進(jìn)行監(jiān)測(cè)跟蹤(硅膠GF254薄板，展開(kāi)劑為9%甲醇／CH2Cl2)。用紫外燈觀察并記錄斑點(diǎn)的Rf值(光甘草定的Rf值為0.42)。</p><p><b>　　甘草（50

12、克）</b></p><p>　　丙酮提取，過(guò)濾，減壓濃縮</p><p>　　丙酮提取物(提取物I)</p><p><b>　　氯仿-鹽酸萃取</b></p><p>　　無(wú)機(jī)溶劑 有機(jī)溶劑 沉淀 </p><p><b>

13、;　　減壓蒸干</b></p><p>　　甲醇-環(huán)己烷提取 </p><p>　　甲醇液 提取物Ⅱ 環(huán)己烷液</p><p><b>　　提取物Ⅲ</b></p><p><b>　　上氧化鋁層析柱</b></p>&

14、lt;p>　　組分Ⅰ（極性?。?組分Ⅱ（極性中等）(提取物III)</p><p><b>　　上硅膠柱</b></p><p>　　組分Ⅰa 組分Ⅱb 組分Ⅲc</p><p><b>　　制備型TLC分離</b></p>

15、<p><b>　　苯/環(huán)己烷重結(jié)晶</b></p><p>　　Glabridin </p><p>　　圖2　光甘草定的提取分離流程圖</p><p>　　3.4 光甘草定的制備工藝改進(jìn)[7]</p><p>　　利用3種方法對(duì)光果甘草總黃酮粗提物進(jìn)行制備，并比較提取效果。</p><p

16、>　　(1)取甘草根粉末lkg，用二氯甲烷回流提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，得棕色浸膏25g(提取物Ⅰ)。</p><p>　　(2)取甘草根粉末lkg，用95％ 甲醇回流提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，得棕色浸膏45g(提取物Ⅱ)。</p><p>　　(3)取甘草根粉末lkg，用95％ 乙醇回流提取3次，合并3次提取液，減壓濃縮至干，得棕色浸膏48g(提取物Ⅲ)

17、。</p><p>　　取2g提取物I，裝載硅膠層析拄，以CH2C12／MeOH(9：1)為洗脫液進(jìn)行分離，得到6個(gè)組分。其中組分5具有光甘草定的特征(硅膠薄層Rf值為0．42)。將組分5用制備型薄層板進(jìn)行分離(展開(kāi)劑為CH2C12／MeOH一91：9)，收集Rf值為0．42的色帶，并用丙酮提取，減壓濃縮至干，用甲苯／環(huán)己烷混合溶劑(3：1)進(jìn)行重結(jié)晶，得Glabridin純品。</p><p

18、>　　按文獻(xiàn)方法對(duì)光甘草定3種粗提物中的光甘草定含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)光果甘草中光甘草定的提取率進(jìn)行考察，再利用硅膠柱層析和制備薄層層析法對(duì)光甘草定進(jìn)行分離純化結(jié)果見(jiàn)表1。</p><p>　　表1 3種光果甘草粗提物中光甘草定的百分含量 </p><p>　　表1中的數(shù)據(jù)顯示，利用二氯甲烷提取得到的提取物Ⅰ中光甘草定的百分含量較高(達(dá)2.9%)，但利用此法時(shí)光甘草定的提取量小，即從lkg

19、甘草中可獲得0.725g光甘草定；利用甲醇提取得到的提取物Ⅱ中，雖然光甘草定的含量稍低(2.6%)，但光甘草定的提取量較大(1.170g/1kg甘草)，即提取較徹底；利用乙醇提取時(shí)，效果與甲醇提取的類似?？紤]到環(huán)保和安全等問(wèn)題(如甲醇的毒性和二氯甲烷對(duì)環(huán)境的污染)，建議利用乙醇提取法更適合于工業(yè)化生產(chǎn)光甘草定提取物。</p><p>　　該方法分別利用二氯甲烷、甲醇和乙醇等3種溶劑提取法，對(duì)光果甘草中光甘草定的提

20、取率進(jìn)行考察；再利用硅膠柱層析和制備薄層層析法對(duì)光甘草定進(jìn)行分離純化，對(duì)文獻(xiàn)工藝進(jìn)行簡(jiǎn)化。利用3種不同提取方法獲得的光果甘草總黃酮粗提物中，用乙醇提取光果甘草總提取物具有提取率高、安全和環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)；利用硅膠柱層析法對(duì)粗提取物中的不同極性組分進(jìn)行分離、再利用制備薄層法進(jìn)行分離純化，在快速制備高純度的光甘草定中具有一定參考價(jià)值，此方法比文獻(xiàn)工藝簡(jiǎn)便易行。</p><p>　　3.5 光甘草定的檢測(cè)方法 </p&

21、gt;<p>　　采用高效液相色譜法檢測(cè)光甘草定的含量。檢測(cè)條件如下[8]，色譜柱：SymmetryC18反相色譜柱(5μm，4.6 mm×250 mm)， 流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸(55：44：1)，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)282nm，進(jìn)樣量10μL。光甘草定在0.09～0.45 mg·mL 內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0．999 7)，平均回收率100.2％，RSD為0.89％。反相高效液相色譜法簡(jiǎn)便、快速、

22、重復(fù)性好，適用于光果甘草中光甘草定的含量測(cè)定。</p><p>　　a對(duì)照品為光甘草定對(duì)照品(購(gòu)于成都普思生物科技有限公司，純度為99.07％。而b樣品則為實(shí)驗(yàn)室分離得到，純度為85%以上。利用硅膠柱層析，洗脫液梯度分別為：CHCl3、CHCl3／MeOH(300：1)、CHCl3／MeOH(100：1)、CHCl3／MeOH(50：1)、MeOH，硅膠薄層板跟蹤點(diǎn)板。最后合并含有光甘草定的餾分，利用高效液相色譜

23、儀檢測(cè)純度。在上述的測(cè)量條件下，對(duì)照品和樣品的HPLC液相圖譜見(jiàn)圖2。</p><p>　　圖2 光甘草定對(duì)照品及樣品HPLC液相圖譜</p><p>　　4 光甘草定的應(yīng)用前景</p><p>　　光甘草定（Glabridin）的生物活性和藥理作用研究目前成為天然黃酮類化合物研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。[9]</p><p><b>　　4

24、.1 抗氧化作用</b></p><p>　　Glabridin的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有異黃酮母核，A環(huán)和B環(huán)為芳環(huán)，B環(huán)上有2個(gè)酚羥基，C9-位上有個(gè)烯鍵。因此，Glabridin具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Vaya等經(jīng)AAPH(2,2-鹽酸脒基丙烷)介導(dǎo)的自由基氧化系統(tǒng)中觀察Glabridin對(duì)LDL被自由基氧化的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Glabridin可有效地阻止LDL氧化變質(zhì)，以4O-60µmol／L的

25、濃度抑制LDL的氧化率為90%。</p><p>　　4.2抗動(dòng)脈粥樣硬化和降血脂作用 </p><p>　　光果甘草提取物及Glabridin以明顯強(qiáng)的抗氧化能力阻止低密度脂蛋白的氧化變質(zhì)，從而防止動(dòng)脈粥樣硬化癥的發(fā)生和發(fā)展。Aoki等[10] 觀察含Glabridin的甘草黃酮油(Licorice flavonoid oil，LFO)對(duì)人體的保健作用和安全性，發(fā)現(xiàn)LFO1200 mg／

26、d的劑量對(duì)人體是安全的，并具有防治動(dòng)脈粥樣硬化等功效。</p><p>　　4.3神經(jīng)保護(hù)和增強(qiáng)記憶作用 </p><p>　　Yu等[11]經(jīng)體內(nèi)外藥理實(shí)驗(yàn)，研究Glabridin對(duì)大腦巾動(dòng)脈閉塞性腦損傷及星形孢菌素誘導(dǎo)損害的人鼠皮層神經(jīng)元的保護(hù)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Glabridin以25 mg／kg劑量在兩種試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校ㄟ^(guò)明顯降低腦內(nèi)MDA濃度和增強(qiáng)內(nèi)原性抗氧化劑SOD和GSH 的活性，

27、顯著減輕腦損傷程度，并抑制星形孢菌素誘導(dǎo)的大鼠皮層神經(jīng)元損傷。Glabridin對(duì)腦細(xì)胞的以上保護(hù)作用具有劑量依賴性特點(diǎn)。</p><p>　　4.4雌激素樣活性 </p><p>　　Glabridin具有類似雌激素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，能產(chǎn)生雌激素樣活性。Snait等[12]經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Glabridin作為一種植物性雌激素，能夠進(jìn)入予富細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體，產(chǎn)生類似雌激素的生物活性，其以

28、2.5～25mg／每只老鼠的劑量所產(chǎn)生的雌激素活性強(qiáng)度與5 mg／每只動(dòng)物的雌二醇相當(dāng)。</p><p>　　4.5抑制黑色素形成作用 </p><p>　　Yokota等[13]觀察Glabridin在B16黑色素瘤小鼠體內(nèi)對(duì)黑色素細(xì)胞形成和炎癥發(fā)生以及對(duì)豚鼠皮膚的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Glabridin以0.1～1.0μg／ml的濃度顯著抑制酪氨酸酶的兩種亞型一T1和T3 tyrosinas

29、e的活性，并產(chǎn)生顯著的抗炎作用，對(duì)皮膚產(chǎn)生明顯的增白效果，從而在化妝品領(lǐng)域內(nèi)顯示良好的應(yīng)用價(jià)值?，F(xiàn)Glabridin已成為許多高級(jí)化妝品的主要增白成分。</p><p><b>　　4.6減肥作用 </b></p><p>　　Aoki[14]等對(duì)含Glabridin的甘草黃酮油(LFO，1.2%的甘草黃酮與甘油三酯混合而成)對(duì)肥胖老鼠的減肥效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

30、LFO經(jīng)8周用藥后，明顯減少腹部堆積的白色脂肪含量。</p><p>　　4.7其他藥理作用 </p><p>　　Jong等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Glabridin對(duì)于在臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子(TNF—a)刺激所引起的細(xì)胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1，IcAM-1)的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。</p><p>　　F

31、ukai等[16]在患有腎小球疾病的小鼠模型巾，觀察Glabridin對(duì)血象的影響，通過(guò)以3O mg·kg·d的劑量10d給藥治療發(fā)現(xiàn)，用Glabridin治療組對(duì)蛋白尿的降低率(47±4)mg/d明顯高于對(duì)照組(100±23)mg/d，即Glabridin對(duì)腎炎有治療作用。</p><p>　　Glabridin通過(guò)抑制細(xì)胞色素P450家族中的有關(guān)氧化代謝酶的活性，對(duì)有些

32、致癌物的激活有抑制作用[17]。</p><p>　　此外，光甘草定還具有抗炎、抗?jié)兗翱咕茸饔?應(yīng)用前景廣闊。趙全民等[18-19]選取傳統(tǒng)中藥甘草提取光甘草定，通過(guò)MABA藥物敏感性實(shí)驗(yàn)方法研究其對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv和H37Ra的體外抗菌活性，并通過(guò)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定了光甘草定對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明單體化合物光甘草定對(duì)結(jié)核分枝桿菌有很好的抗菌活性，最低

33、抑茵濃度均為25μg/ml；光甘草定對(duì)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和大腸桿菌也有抗菌活性，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性桿菌的抗菌活性高于革蘭氏陰性桿菌。</p><p><b>　　5 總結(jié)</b></p><p>　　Glabridin的抗氧化、降血脂、抗炎等作用在阻止心血管疾病的病理基礎(chǔ)，LDL脂蛋白的氧化、血管內(nèi)皮細(xì)胞被炎癥因子損傷和高脂血癥等方面具有重要意義，這使

34、Glabridin在人類疑難癥-心血管疾病的有效藥物干預(yù)中將擁有重要研究?jī)r(jià)值；Glabridin的抗腦損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞和提高認(rèn)知能力等生物活性使它在老年癡呆癥的創(chuàng)新藥物研究中顯示較好的研究潛力；Glabridin的抑制酪氨酸酶和抗炎活性使它在化妝品[20]原料研究開(kāi)發(fā)中體現(xiàn)重要價(jià)值。 </p><p>　　Glabridin是光果甘草所特有的一種黃酮類活性成分。光果甘草主要分布在我國(guó)西部地區(qū)，資源豐富，有野生和

35、人工栽培基地，儲(chǔ)備量較大。Glahridin是在光果甘草精制總黃酮中含量最高的成分，約占11%，有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。光甘草定被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品藥品等行業(yè)，藥理活性和經(jīng)濟(jì)價(jià)值越來(lái)越受到重視，而現(xiàn)有研究光甘草定提取工藝條件的文獻(xiàn)很少，因此有必要對(duì)光甘草定的提取最佳工藝條件做更深入的研究，并有很良好的應(yīng)用發(fā)展前景。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><

36、;p>　　[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典(一部)[S]．北京：中國(guó)化學(xué)工業(yè)出版社，2005：59-60．</p><p>　　[2] 傅乃武，劉朝陽(yáng)，張如意．甘草黃酮體抗促癌、抗致突和氧化作用的研究[J ]．天然產(chǎn)物的研究與開(kāi)發(fā)，1995，7(4)：29．</p><p>　　[3] KUNTZ S，WENZEL U，DANIEL H．Comparative analysis of

37、 the effects of flavonoids on proliferation，cytotoxicity，and apoptosis in human colon cancer cell lines[J]．Eur J Nutr，1999，38(3)：133-142．</p><p>　　[4] MOURBOUL A，RENA K，et a1．Isolation and Antioxidant Proper

38、ty of Glabridin[J]．Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2007，19(4)：675-682．</p><p>　　[5] Kulisic TA，Radonic V，Katalinic MM．Use of diferent methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil．Food Chem

39、istry，2004，85：633-640．</p><p>　　[6] 木合布力·阿布力孜，熱娜·卡斯木，馬淑燕，等．甘草中光甘草定的提取和抗氧化活性研究[J]．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2007，19：675-677．</p><p>　　[7] 賽力曼·哈得爾,李宏智,木合布力·阿布力孜，等．新疆甘草黃酮類成分光甘草定的制備工藝改進(jìn)[J]．亞太傳統(tǒng)醫(yī)

40、藥，2008,4(9)：27-29．</p><p>　　[8] 閔杰，木合布力·阿布力孜，孟磊，李宏智，等．RP—HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地光果甘草廢渣中光甘草定含量[J]，中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27（7）：637-640．</p><p>　　[9] 木合布力·阿布力孜，閔杰，迪力夏提·艾尼瓦爾，等．光甘草定的制備方法及藥理作用研究進(jìn)展[J]．新疆醫(yī)科大學(xué)

41、學(xué)報(bào)，2009，32（11）：1626-1628．</p><p>　　[10] Aoki F，Nakagawa K，Kitano M，et a1．Clinical safety of licorice flavonoid oil(LFO)and pharmacokinetics of glabridin in healthy humans[J]．J Am Coll Nutr，2007，26(3)：209～218

42、．</p><p>　　[11] Yu XQ，Xue CC，Zhou ZW，et a1．In vitro and in vivo neuro-protective effect and mechanisms of glabridin，a major active isoflavan from Glycyrrhiza glabra (1icorice)[J]．Life Sci，2008，82(12)：68-78．&

43、lt;/p><p>　　[12] Snait T，Mark E，Dalia S．Estrogenic and antipro1iferative properties of glabridin from licorice in human breast cancer cells[J]．Cancer Res，2000，60(20)：5704-5709．</p><p>　　[13] Yokota

44、 T，Nishio H，Kubota Y，et a1．The inhibitory effect of glabridin from licorice extracts 0n meIanogenesis[J]．Pigment Cell Res，1998，11(6)：355-661．</p><p>　　[14] Aoki F，Honda S，Kishida H，et a1．Suppression by licor

45、ice flavonoids oi abdominal fat accumulation and body weight gain in high-fat diet-induced obese C57BL/6J mice[J]．Biosci Biotechnol Biochem，2007，71(1)：206-214．</p><p>　　[15] Jong SK，Yeo DY，Mi HH，et a1．Glabri

46、din suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression in tumor necrosis factor-α-stimulated human umbilical vein endothelial cells by blocking sphingosine kinase pathway：implications of akt，extracellular signal-reg

47、ulated kinase，and nuclear faetor-B/Relsignaling pathways[J]．Mol Pharmacol，2006，69：941-949．</p><p>　　[16] Fukai T，Satoh K，Nomura T，et a1．Preliminary evaluation of antinephritis and radical scavenging activiti

48、es of glabridin from glycyrrhiza glabra[J]．Fitoterapia，2003，74(7-8)：624-629</p><p>　　[17] 馬淼,周旭莉,戶元林,肖輝,李學(xué)禹.烏拉甘草有效成分對(duì)人體4種腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(1):9-11.</p><p>　　[18] 田莉,商曉黎.甘草的抗腫瘤作用[J].