miR-148a-TGF-β信號通路在光甘草定抑制腫瘤干細胞樣特性中的作用.pdf

1、近年來流行病學研究表明，一些植物化學物的攝入水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，并且由于其高效、低毒的特性備受關注。它們可通過抑制致癌物在體內(nèi)的活化，誘導細胞保護酶，抑制炎癥反應，調(diào)節(jié)免疫活動，阻滯細胞周期和促進細胞凋亡，改變信號通路等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。光甘草定(Glabridin，GLA)作為甘草的主要有效成分之一，也具有廣泛的藥理活性，如美白、抗炎、抗菌、抗氧化、心血管和神經(jīng)保護作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，光甘草定也具有抑制腫瘤增殖、侵

2、襲轉移和血管生成等作用。
　　腫瘤干細胞是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細胞特性的細胞群體，它們具有自我更新、高度增殖和多向分化能力，在腫瘤的發(fā)生、侵襲轉移、復發(fā)及耐藥等方面起著決定性的作用。腫瘤干細胞的存在很好地解釋了腫瘤在治療初期會有縮小甚至消失，但會很快復發(fā)導致患者死亡的現(xiàn)象。深入研究腫瘤干細胞的生物學特性以及相關信號通路并針對腫瘤干細胞尋找特異性靶向藥物，成為腫瘤治療新的理論基礎和途徑。
　　miRNA可作為癌基因

3、或抑癌基因廣泛參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移等多個生物學過程并成為當前研究熱點。miRNA在腫瘤干細胞中也發(fā)揮著重要的作用，目前已發(fā)現(xiàn)多個miRNA能夠通過靶向調(diào)控多個靶基因的表達進而作用于下游的多條信號通路，最終影響腫瘤干細胞的致瘤能力并改變其惡性表型。因此，以miRNA為治療靶點的治療策略將成為腫瘤治療的一個新的途徑。
　　基于以上研究背景，假設光甘草定可通過改變某些miRNA的表達，進而調(diào)控與腫瘤干細胞特性相關的信號通路從而發(fā)揮抑

4、制腫瘤干細胞樣特性的作用，為光甘草定在腫瘤預防及治療的應用提供科學依據(jù)。
　　目的:
　　本研究采用人乳腺癌細胞(MDA-MB-231、Hs-578T)和人肝癌細胞（HepG2、MHCC97H、Huh7）為體外模型，以MDA-MB-231細胞接種裸鼠形成的移植瘤為體內(nèi)模型，探討光甘草定能否通過miRNA抑制腫瘤干細胞樣特性發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　方法:
　　采用RT-PCR及qRT-PCR檢測光甘草定對miR-14

5、8a、腫瘤干細胞表面抗原的影響;采用流式細胞術、軟瓊脂集落實驗及懸浮球形成實驗分別檢測腫瘤細胞的側群細胞比例、增殖程度及自我更新能力;采用qRT-PCR及WesternBlot檢測TGF-β信號通路中SMAD2的表達和磷酸化水平，以及snail的表達;采用雙熒光素酶報告基因實驗檢測miR-148a對SMAD2的靶向抑制作用;采用甲基化特異性PCR檢測光甘草定對miR-148a啟動子區(qū)甲基化水平的影響;用免疫組化檢測SMAD2的組織表達及

6、定位情況。
　　結果:
　　1.光甘草定對腫瘤干細胞樣特性的影響
　　用10μM GLA分別處理乳腺癌MDA-MB-231細胞0、24、48和72 h后，乳腺癌腫瘤干細胞表面抗原（CD44和ALDH-1）、自我更新指標（Oct-4和BMI-1）的mRNA表達呈時間依賴性下降;0、10、20μM GLA處理肝癌HepG2細胞72 h后，肝癌HepG2細胞的腫瘤干細胞表面抗原(CD44、EpCAM、CD133和CD90)、

7、自我更新指標（Oct-4和BMI-1）的mRNA表達呈劑量依賴性下降;在肝癌Huh-7和MHCC97H細胞中，GLA同樣抑制CD44和EpCAM的mRNA表達;10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231細胞72 h后，側群細胞比例、軟瓊脂集落及懸浮球形成數(shù)明顯下降;在肝癌中，20μM GLA抑制HepG2和MHCC97H細胞軟瓊脂集落形成以及HepG2和Huh-7細胞懸浮球形成能力。
　　2.TGF-β信號通路在腫瘤干細胞樣特

8、性中的作用
　　10 ng/mL TGF-β處理肝癌HepG2細胞48h，可明顯上調(diào)肝癌HepG2細胞的干細胞表面抗原（CD44和EpCAM）的mRNA表達以及明顯增加軟瓊脂集落和懸浮球形成數(shù)量。
　　用SMAD2-siRNA轉染肝癌HepG2細胞12 h后，再加入10 ng/mL TGF-β處理48 h，發(fā)現(xiàn)TGF-β處理下的肝癌HepG2細胞的干細胞表面抗原(CD44和EpCAM)的mRNA表達下降;軟瓊脂集落形成數(shù)和懸

9、浮球形成數(shù)量均有減少。
　　3.光甘草定對TGF-β信號通路的影響
　　10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231細胞72h后，再加入10 ng/mL TGF-β處理12h后，結果發(fā)現(xiàn)，GLA降低了TGF-β誘導的p-SMAD2;10μM GLA處理HepG2細胞72 h后，再加入10 ng/mL TGF-β處理12h后，結果發(fā)現(xiàn)，GLA降低了TGF-β誘導的p-SMAD2及Snail的表達;同時，GLA抑制了SMAD2

10、總蛋白及mRNA的表達。
　　用10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231細胞0、24、48和72 h后，p-SMAD2及總SMAD2的蛋白及RNA水平呈劑量依賴性降低;在肝癌HepG2細胞中用0、10或20μM GLA處理HepG2細胞72 h后，p-SMAD2及總SMAD2的蛋白水平以及SMAD2及其下游Snail mRNA的表達降低;同時，GLA抑制了Huh-7和MHCC97H細胞中SMAD2及Snail mRNA的表達

11、。
　　4.光甘草定對miR-148a表達的影響
　　在MDA-MB-231細胞中，mimic-148a/WT質(zhì)粒共轉染組細胞的相對熒光強度比Con-mimic/WT質(zhì)粒共轉染組細胞明顯下降，而mimic-148a/MT質(zhì)粒共轉染組細胞的相對熒光強度與Con-mimic/MT質(zhì)粒共轉染組細胞相比無明顯改變。mimic-miR-148a轉染肝癌Huh-7細胞后，miR-148a表達升高的同時SMAD2mRNA及蛋白表達均下降。

12、
　　10μM GLA處理乳腺癌MDA-MB-231和Hs-578T細胞0、24、48和72 h后，可時間依賴性上調(diào)miR-148a的表達。在肝癌HepG2、Huh-7、MHCC97H細胞中，20μM GLA均可上調(diào)miR-148a的表達。
　　5.光甘草定對miR-148a啟動子區(qū)甲基化的影響
　　10μM GLA分別處理乳腺癌MDA-MB-231細胞72 h，qMSP結果發(fā)現(xiàn)，GLA處理后miR-148a的甲基化水

13、平下降;同時，DNA甲基轉移酶(DNMT1、DNMT3a)表達受抑制。
　　6.光甘草定通過miR-148a抑制TGF-β信號通路
　　在乳腺癌MDA-MB-231、Hs-578T細胞和肝癌HepG2細胞中分別轉染anti-miR-148a抑制miR-148a的表達，再加入GLA處理，結果發(fā)現(xiàn)GLA對miR-148a的上調(diào)作用被削弱，對SMAD2 mRNA、p-SMAD2及SMAD2總蛋白表達的抑制作用也被削弱。
　　

14、7.miR-148a在光甘草定抑制腫瘤間質(zhì)特征中的作用
　　在乳腺癌MDA-MB-231細胞中，用anti-miR-148a抑制miR-148a表達后，可削弱GLA對Vimentin的抑制作用和對ZO-1及E-cadherin的上調(diào)作用。
　　8.miR-148a在光甘草定抑制腫瘤干細胞樣特性中的作用
　　在乳腺癌MDA-MB-231、Hs-578T細胞和肝癌HepG2、Huh-7細胞中分別轉染anti-miR-148

15、a可阻滯GLA對腫瘤干細胞表面抗原(CD44、ALDH-1、EpCAM)的下調(diào)作用，同時受GLA抑制的側群細胞比例、軟瓊脂集落和懸浮球形成數(shù)量重新上調(diào)。
　　9.光甘草定在裸鼠移植瘤模型中調(diào)控腫瘤干細胞樣特性
　　在裸鼠皮下乳腺癌移植瘤模型中發(fā)現(xiàn)GLA抑制裸鼠移植瘤的生長;乳腺癌腫瘤干細胞表面抗原（CD44和ALDH-1）和自我更新指標（Oct-4和BMI-1）均有不同程度下降;miR-148a的水平明顯上調(diào)，且miR-14