光甘草定抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和誘導(dǎo)凋亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：探究光甘草定（glabridin）對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO和HCT116細(xì)胞的遷移和凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：不同濃度的光甘草定、MLCK抑制劑ML-7、ROCK抑制劑H-1152以及p38通路抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125和PKC激活劑PMA處理RKO和（或）HCT116細(xì)胞；采用MTT比色法檢測(cè)光甘草定對(duì)RKO和HCT116細(xì)胞活力的影響，平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)光甘草定對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞克

2、隆形成能力的影響，通過Hoechst33258染色檢測(cè)光甘草定對(duì)RKO細(xì)胞凋亡的影響；通過細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察光甘草定對(duì)RKO和HCT116細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；免疫熒光檢測(cè)光甘草定處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后E-cadherin、N-cadherin以及HCT116細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的變化。Western blot檢測(cè)RKO細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白（BCL-2、Bax、Caspase家族），HCT116細(xì)

3、胞中緊密連接蛋白ZO-1、occludin，RKO和HCT116細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin以及遷移相關(guān)蛋白（RhoA、 ROCK、MLCK、MLCP、p-MLC）以及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并加入抑制劑和激活劑分析其可能的機(jī)制。
　　結(jié)果：光甘草定作用于RKO和HCT116細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的增殖、克隆形成能力和遷移、侵襲有明顯抑制作用。光甘草定誘導(dǎo)RKO細(xì)胞凋亡，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Pr

4、ocaspase9表達(dá)水平和上調(diào)Bax、Caspase3蛋白表達(dá)，而對(duì)Caspase8蛋白表達(dá)影響不明顯。光甘草定處理后，RKO和 HCT116細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MYPT1磷酸化水平及 MLC磷酸化水平下調(diào)，RKO細(xì)胞內(nèi) RhoA、ROCK1、ROCK2表達(dá)水平均明顯下調(diào)，而HCT116細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCK1、ROCK2蛋白無明顯變化；為進(jìn)一步的驗(yàn)證，我們采用 MLCK的特異性抑制劑ML-7或 ROCK的特異性抑制劑H-1152處理R

5、KO和（或）HCT116細(xì)胞，觀察到二者對(duì)RKO和（或） HCT116細(xì)胞的遷移存在抑制作用且能下調(diào) MLCK、ROCK1或p-MYPT1蛋白的表達(dá)，提示光甘草定可能通過抑制 MLCK和ROCK活性而抑制 RKO和（或）HCT116細(xì)胞的遷移能力。光甘草定在不同時(shí)間點(diǎn)處理結(jié)直腸癌細(xì)胞后，兩株細(xì)胞中ERK無明顯變化，RKO細(xì)胞內(nèi)JNK磷酸化水平先上升后下降，p38通路上調(diào)，而HCT116細(xì)胞中JNK通路下調(diào)后恢復(fù)，p38通路上調(diào)。加入JN

6、K和p38/MAPK通路抑制劑后能下調(diào)遷移相關(guān)蛋白MYPT1和MLC的磷酸化水平，表明光甘草定可能部分通過JNK信號(hào)通路，下調(diào)MLC磷酸化水平，從而導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力降低而抑制遷移。光甘草定能抑制RKO和HCT116細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，上調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物 E-cadherin，下調(diào)間葉細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin；并且上調(diào)HCT116細(xì)胞膜上緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的蛋白水平。
　　結(jié)論：光甘草定抑制結(jié)直腸癌RKO