青花菜蘿卜硫素累積相關(guān)基因MY和SMT的功能分析.pdf

1、青花菜(Brassica oleracta L.var.italica planch)是發(fā)達(dá)國(guó)家進(jìn)口量最大的蔬菜之一。不但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且富硒,更具特色的是其含有迄今為止在蔬菜中發(fā)現(xiàn)的預(yù)防抑制癌癥活性最強(qiáng)的天然活性成分-蘿卜硫素(Sulforaphane,SFN)。研究表明,SFN是由黑芥子酶(Myrosinase,MY)水解4-甲基亞磺酰丁基硫苷生成的,在代謝中受硒脅迫含量會(huì)急劇降低。硒甲基轉(zhuǎn)移酶(SMT)可將硒轉(zhuǎn)化為非蛋白源含硒氨基酸的

2、形式儲(chǔ)存于植株內(nèi),并可能參與調(diào)控SFN。本研究對(duì)MY和SMT基因的功能進(jìn)行分析,可為SFN的調(diào)控研究提供理論依據(jù),并且為定向選育高SFN品種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　 (1)利用本實(shí)驗(yàn)室從芥藍(lán)中克隆獲得的MY基因序列分別構(gòu)建過量表達(dá)載體1301-MY和RNAi表達(dá)載體1301-MY RNAi,并以pCAMBIA1301空載體為轉(zhuǎn)化對(duì)照,分別轉(zhuǎn)化青花菜；分別獲得了64株、49株、47株轉(zhuǎn)基因植株,陽(yáng)性率分別為90.14％、85

3、.96％、88.68％,根組織GUS染色陽(yáng)性率分別為81.69％、77.19％、75.47％。Southern blot結(jié)果表明,目的片段以單拷貝的形式插入青花菜基因組DNA中。
　　 (2)熒光定量PCR反應(yīng)表明,MY基因過量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株MY基因的相對(duì)表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因植株平均提高16.5％；RNAi表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株MY基因的相對(duì)表達(dá)量平均降低23.8％,差異均達(dá)到顯著水平。過量表達(dá)MY基因使轉(zhuǎn)基因青花菜花球SFN含量比未轉(zhuǎn)

4、基因植株增加92.77％；RNA干擾MY基因使轉(zhuǎn)基因青花菜花球SFN含量比未轉(zhuǎn)基因植株降低35.82％?？赏茢嘟嫠{(lán)MY基因在青花菜中也可參與SFN的合成；
　　 (3)利用本實(shí)驗(yàn)室克隆的青花菜SMT基因構(gòu)建過量表達(dá)載體1301-SMT和RNAi表達(dá)載體1301-SMT RNAi,并以pCAMBIA1301空載體為轉(zhuǎn)化對(duì)照,分別轉(zhuǎn)化青花菜。分別獲得陽(yáng)性植株60株(1301-SMT)、67株(1301-SMT RNAi)、47株(p

5、CAMBIA1301),陽(yáng)性率分別為88.24％、91.78％、88.68％。根組織GUS染色陽(yáng)性率分別為82.35％、80.82％、75.47％。Southern blot結(jié)果表明,目的片段以單拷貝的形式插入青花菜基因組DNA中。
　　 (4)熒光定量PCR檢測(cè)表明,SMT基因過量表達(dá)使轉(zhuǎn)基因植株SMT基因的相對(duì)表達(dá)量比非轉(zhuǎn)基因植株平均提高13.93％,差異達(dá)顯著水平；RNAi使轉(zhuǎn)基因植株SMT基因的相對(duì)表達(dá)量平均降低15.6

6、％,差異達(dá)顯著水平。過量表達(dá)SMT基因使陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因青花菜花球SFN含量比非轉(zhuǎn)基因植株增加64.12％,RNA干擾SMT基因卻未引起花球SFN含量明顯變化。硒脅迫處理(5.2 mmol／L Na2SeO4)后,各組轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓陜?nèi)SFN含量均降低。其中,過量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的SFN含量比處理前減少14.09％,RNA干擾SMT基因表達(dá)引起SFN含量的急劇降低(未檢測(cè)到SFN含量)?？赏茢郤MT基因在青花菜SFN的累積過程中具有重