稀有鮈鯽microRNA的鑒定及在水生態(tài)毒理學上的初步應用.pdf

1、MicroRNAs（miRNAs）是一類重要的內(nèi)源性短的（～22個核苷酸的長度）單鏈非編碼RNA(ncRNA)，存在于動物、植物等真核生物以及某些病毒中，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡、衰老及代謝等生物體內(nèi)的多個生理生化過程。研究顯示，miRNAs的異常表達與許多人類疾病的發(fā)生密切相關。雖然已有大量文獻報道了PAHs對人類健康的危害，但大部分工作還主要集中在對高分子量PAHs的研究上，忽略了低分子量PAHs的環(huán)境危害。
　　稀有鮈鯽

2、(Gobiocypris rarus)是中國一種小型鯉科土著魚類，已被廣泛用作水生實驗用魚。鑒定稀有觴鯽的miRNAs基因信息是發(fā)現(xiàn)miRNA的生物學功能和篩選新的分子生物標志物，以評估未來環(huán)境污染的風險的第一步。然而，稀有鮈鯽的相關生物學數(shù)據(jù)如miRNA轉錄組數(shù)據(jù)并沒有獲得。
　　本研究借助Illunima高通量測序技術獲取了稀有鮈鯽的miRNAs生物學信息。以菲(Phenanthrene，Phe)為例，研究了成年稀有鮈鯽（～5

3、個月）在濃度為10μg/L、100μg/L、1000μg/L的Phe溶液中暴露30d后的肝臟毒性效應。
　　主要研究結果如下:
　　1.構建了一個從稀有鮈鯽6個不同組織（腦、眼、肝臟、鰓、肌肉和心）中提取的等量RNA構成的混合文庫，并通過illumina高通量測序技術進行測定，共獲得26，930，553個原始序列和2，118，439個高質量序列。通過生物信息學分析首次在稀有鮈鯽中發(fā)現(xiàn)并注釋了352個保守的以及112個候選的新

4、miRNAs。
　　2.對Phe處理組的稀有鮈鯽肝臟組織進行TUNEL和Hoechst33342染色，染色結果均顯示隨著暴露濃度的升高，肝臟細胞凋亡數(shù)目也隨之增加，其中10μg/L和100μg/L的處理濃度顯著誘導了肝臟細胞的凋亡發(fā)生。此外還發(fā)現(xiàn)caspase3酶活性在10μg/L和100μg/L的處理組顯著上升，caspase9的活性僅在1000μg/L的處理組中顯著上調(P＜0.05），caspase8各濃度處理組均無顯著上調

5、。綜合上述組織學染色和細胞凋亡過程中caspase3、caspase8和caspase9酶活性的試驗結果表明，Phe通過caspase9介導的內(nèi)源性途徑引起了稀有鮈鯽肝臟細胞凋亡的發(fā)生。
　　3.采用qPCR法檢測p53信號通路中的細胞周期以及細胞凋亡相關基因在稀有鮈鯽肝臟中的表達情況。細胞周期調控基因p21和gadd45α的表達量在各濃度組均顯著上調(P＜0.05)，其中10μg/L和100μg/L的處理組與對照組相比上調倍數(shù)均

6、10倍以上?？辜毎蛲龌騜cl-2表達量在100μg/L和1000μg/L濃度組沒有顯著變化，而10μg/L濃度組基因表達量明顯增加(P＜0.05）。與對照組相比，促凋亡基因bax的表達情況正好與bcl-2相反，在高濃度組(100μg/L和1000μg/L)顯著誘導(P＜0.05)。
　　4.采用poly(A)加尾法測定了Phe對稀有鮈鯽肝臟miR-17～92 cluster(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR