南極中山站周邊沙土中細菌耐藥圖譜及其耐藥基因檢測【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設(shè)計）</p><p>　　論文題目：南極中山站周邊沙土中細菌耐藥圖譜及其耐藥基因檢測</p><p>　　所在學院 生物與環(huán)境學院 </p><p>　　專業(yè)班級 環(huán)境工程 </p><p>　　學生姓名 學號

2、 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　本論文在前期從南極沙土樣品分離到72株細菌，并檢測了對四環(huán)素類（四環(huán)素）和β-內(nèi)酰

3、胺類（頭孢哌酮、頭孢噻吩、頭孢孟多，青霉素G）的耐藥狀況的基礎(chǔ)上檢測各自耐藥基因型。本論文根據(jù)文獻合成了23種引物，利用PCR技術(shù)對已知耐藥表型的細菌進行耐藥基因類型檢測，經(jīng)過PCR擴增檢測，對陽性反應產(chǎn)物回收、克隆測序獲得片段序列，根據(jù)測序結(jié)果與已知耐藥基因序列比對分析最終確定耐藥基因型。實驗結(jié)果表明，耐四環(huán)素基因型共13株菌，在利用所有引物公獲得結(jié)果231個，其中陽性結(jié)果19個，最終檢測序列比對分析得到9株細菌的耐藥基因型，分別是T

4、ET（B）型6株、TET(Q)型2株，TET（W）型1株；耐氨芐青霉素基因型共41株，共利用3對引物獲得結(jié)果68個，其中陽性結(jié)果22個，確定SHV型18株。該研究結(jié)果為研究人類活動對南極環(huán)境的影響及耐藥基因在南極沙土中分布和傳播奠定了基礎(chǔ)。</p><p>　　關(guān)鍵詞：耐藥性；耐藥基因；南極；細菌</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p>

5、;<p>　　The basis of drug resistance of this thesis in the earlyseparation of sand samples from the Antarctic to 72 bacteriaand detection of tetracyclines (tetracycline) and beta-lactams(cefoperazone, cephalothin,

6、cefamandole, penicillin G)detected on the respective resistant genotype.This thesis,the 23 kinds of primers were synthesized according to the literature, the type of resistance gene detection using PCRtechnology known dr

7、ug-resistant phenotype of bacteria, afterPCR amplification, the positive r</p><p>　　Key words: Resistance; Resistance gene;Antarctic; Bacteria;</p><p><b>　　目 錄</b></p><p&

8、gt;<b>　　1 前言1</b></p><p>　　1.1 南極沙土中的細菌1</p><p>　　1.2 人類活動對南極環(huán)境的影響1</p><p>　　1.3 極端環(huán)境耐藥基因的研究進展2</p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p&g

9、t;　　2.1 樣品采集與儲運2</p><p>　　2.2 材料與方法4</p><p>　　2.2.1 材料與試劑4</p><p>　　2.2.2 研究方案4</p><p><b>　　3 結(jié)果9</b></p><p>　　3.1 細菌的培養(yǎng)、分離與純化9</p>

10、<p>　　3.2 耐藥性檢測10</p><p>　　3.3 PCR擴增結(jié)果10</p><p>　　3.3.1 耐四環(huán)素基因的PCR擴增結(jié)果10</p><p>　　3.3.2 耐氨芐青霉素基因的PCR擴增結(jié)果12</p><p>　　3.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定14</p><p>　　3.

11、3.4 測序驗證結(jié)果14</p><p>　　4 分析與討論17</p><p>　　4.1 三個站點細菌耐藥性的比較17</p><p>　　4.2 β-內(nèi)酰胺類耐藥細菌基因分析18</p><p>　　4.3 耐四環(huán)素類細菌基因型分析19</p><p>　　4.4 南極沙土中的細菌與其他陸源細菌耐藥基因

12、型的比較20</p><p><b>　　5 結(jié)論21</b></p><p><b>　　參考文獻22</b></p><p><b>　　致 謝25</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>

13、;　　南極大陸又被稱為“第七大陸”，在地理位置上遠離人類活動區(qū)，是地球上受人類活動影響最小的大陸。南極與北極、喜馬拉雅山并稱為世界三大極，三者均擁有全球最為極端的氣候和環(huán)境，其中南極具有極端寒冷、干燥、強風、強紫外線照射等特點，因此也被認為是生命的一大禁區(qū)[1]。</p><p>　　1.1 南極沙土中的細菌</p><p>　　盡管南極大陸的這種惡劣環(huán)境對某些生物體而言是無法生存的，但是

14、對于另外一些生物來說它們卻對這種環(huán)境產(chǎn)生了適應性，并且在這種環(huán)境脅迫和較強的選擇壓力下頑強的存活了下來[2]，正是因為如此在南極才有不同的生命形式和完整的生態(tài)系統(tǒng)存在。這些生物中有很大一部分是古老而且原始的原核生物——細菌，其中嗜冷和耐冷細菌尤為常見，它們在物質(zhì)和能量循環(huán)中也起到了至關(guān)重要的作用。</p><p>　　通過上述描述，我們可以看出無論是從生物學還是環(huán)境科學甚至能源利用的角度對南極沙土中的細菌進行研究

15、都具有非常重要的意義和必要性。本研究選擇南極沙土中的細菌進行研究也正是基于上述考慮。</p><p>　　1.2 人類活動對南極環(huán)境的影響</p><p>　　人類活動勢必會影響到南極脆弱的生態(tài)環(huán)境，對南極生物、環(huán)境以及人類活動對南極沙土中微生物多樣性的影響研究，國內(nèi)外已經(jīng)有諸多報道。肖湘等人利用培養(yǎng)、DGGE、QC-PCR等分子生物學技術(shù)相結(jié)合研究了長城站周邊土壤、湖水中細菌的多樣性，得

16、到了不同土壤環(huán)境中優(yōu)勢菌群的區(qū)別，得到了可培養(yǎng)和非可培養(yǎng)的方法測得的樣品中優(yōu)勢菌群的不同，分析了和人類活動的關(guān)系[3]。Chong等人利用DGGE技術(shù)分析了澳大利亞Casey站周邊不同的8個具有代表型的沙土樣中的細菌多樣性的區(qū)別，并結(jié)合沙土樣的理化特征進行了綜合分析，通過主成分分析法分析了TC、TN、水分、Cu、Fe、Zn等理化因子與微生物多樣性之間的關(guān)系[4]。Saul等通過培養(yǎng)和構(gòu)建16S rRNA文庫的方法系統(tǒng)研究了南極Ross灣

17、石油污染區(qū)土壤中微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)石油污染區(qū)土壤中好氧菌數(shù)目增加1到2個數(shù)量級，主要以Pseudomonas, Sphingomonas 和Variovorax為優(yōu)勢菌群，但是多樣性會明顯減少[5]。以南極生態(tài)生態(tài)微生物多樣性變化為依據(jù)，研究其與人類在南極科考活動的關(guān)系，在最近幾年，在南極大陸其他站點關(guān)于微生物多樣性的研究也有</p><p>　　1.3 極端環(huán)境耐藥基因的研究進展</p><

18、p>　　抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類在醫(yī)學領(lǐng)域里最重要的突破之一，它延長了人類的平均壽命，使得細菌性疾病細菌不會像以往那樣對人類和動物的健康甚至生命造成威脅。然而正是由于各類抗生素的發(fā)展和使用，使得部分細菌產(chǎn)生了耐藥性，并通過脅迫和篩選作用將這種性狀保留下來。</p><p>　　國內(nèi)外研究人員也針對耐藥基因進行了諸多研究。這些研究主要圍繞以下兩方面具體展開：（1）各種生態(tài)環(huán)境中耐藥基因的分布于與抗生素污染之間的關(guān)系

19、[6-7]；（2）極端環(huán)境中耐藥微生物和耐藥基因的多態(tài)性和進化，進而探討耐藥基因的起源[8-9]。Pruden等系統(tǒng)的研究了Colorado州不同環(huán)境中四環(huán)素類和磺胺類耐藥基因的分布狀況和趨勢，并首次明確提出了將耐藥基因作為新型環(huán)境污染物，拉開了生態(tài)環(huán)境耐藥基因的發(fā)現(xiàn)和生態(tài)功能研究的序幕[10]。Mindlin等從北極永凍土中分離到大量耐藥細菌，甚至分離到多重耐藥細菌，但是研究結(jié)果目前仍有爭議[11]。Allen等選擇了人跡罕至的Ala

20、skan永凍土作為研究對象，研究了其中β-內(nèi)酰胺類抗性基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)了古老的β-內(nèi)酰胺類抗性基因[12]。D’Costa等在西伯利亞采集的3萬年前沉積物中發(fā)現(xiàn)ß-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、糖肽類抗性基因，并對其多態(tài)性和進化關(guān)系進行了系統(tǒng)分析[13]。Knapp等對1940年至2008年間連續(xù)68年收集的土壤樣品進行了各類抗性基因的定量檢測，為人類活動對環(huán)境中微生物耐藥影響提供了佐證[14]。</p><p&g

21、t;　　關(guān)于南極環(huán)境中耐藥菌株的發(fā)現(xiàn)已有部分報道[15-16]，而南極沙土環(huán)境中耐藥微生物及基因多樣性的研究尚未見報道。人類活動對南極一定范圍內(nèi)的微生態(tài)影響已有報道，但是是否會影響南極沙土環(huán)境中的耐藥細菌和抗性基因的分布，尚未見報道，需要通過進一步的實驗研究。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p>　　2.1 樣品采集與儲運</p&

22、gt;<p>　　實驗所用沙土樣品（表1）由王佩兒老師參加澳大利亞南極2010/2011V1次科學考察（2010.10-2011.04）采集，樣品的采集得到中國極地考察辦公室和澳大利亞南極局的批準，符合南極公約相關(guān)章程。沙土樣品均于現(xiàn)場用滅菌處理過的藥匙采集于已經(jīng)滅菌的專用袋中（Wendy，90×260mm），迅速置于攜帶的冰桶中，回到考察站后樣品轉(zhuǎn)移到-20℃冷藏庫保藏，回國途中保藏于雪龍船-20℃冷藏庫，運回

23、實驗室保藏與-20℃低溫冰箱。在轉(zhuǎn)運途中利用冰袋和冷藏車確保低溫。各樣本的采集地點分布情況如圖1所示。</p><p>　　表1 采樣點具體說明</p><p><b>　　2.2 材料與方法</b></p><p>　　2.2.1 材料與試劑</p><p><b>　　（1）菌株</b><

24、;/p><p>　　本實驗所用菌株均分離自南極沙土樣；DH5α菌株由本實驗室保存。</p><p><b>　?。?）試劑</b></p><p>　　實驗中所用主要試劑如下：DNA Marker、Loading Buffer、限制性內(nèi)切酶、pMD18-T載體克隆試劑盒等購自TaKaRa公司；瓊脂糖、DNA純化回收試劑盒等購自上海生工生物工程有限公

25、司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。</p><p><b>　?。?）儀器</b></p><p>　　實驗所用儀器情況如下：DYY-11型電泳儀（北京市六一儀器廠）、DYCZ-24D型垂直電泳槽（北京市六一儀器廠）、天能3500-凝膠成像系統(tǒng)、5331-梯度PCR儀、L1低溫連接儀、TGL-16B臺式離心機、YXQ-75SII高壓滅菌鍋等。</p>&

26、lt;p>　　2.2.2 研究方案</p><p><b>　　圖2 研究方案</b></p><p>　?。?）土壤樣本的處理</p><p>　　無菌操作稱取土壤樣1g，放于10mL滅菌帶塞試管中，用滅菌冷卻的PBS緩沖液定容；</p><p>　　劇烈振蕩0.5h，靜置5min，上清即為稀釋10-1 的菌液；

27、</p><p>　　另取裝有10mL滅菌PBS緩沖液的帶塞試管2支，分別編號10-2、10-3；用移液槍吸取1mL 10-1的稀釋液，沿管壁緩緩注入到編號10-2的試管內(nèi)，振蕩試管使其混合均勻，制成10-2稀釋液；</p><p>　　同法可制成10-3稀釋液。</p><p>　?。?）細菌的培養(yǎng)、分離及純化</p><p>　　在對土壤

28、樣本處理結(jié)束后，需要首先對沙土樣本中的細菌進行培養(yǎng)、分離以及純化，這一過程中我們選擇了寡營養(yǎng)的R2A培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的配制方法如下：稱取MgSO4 0.024 g、磷酸氫二鉀0.3 g、丙酮酸鈉0.3 g、蛋白胨D 0.5 g、 淀粉0.5 g、酵母提取物0.5 g、酪氨酸 0.5 g、胰蛋白胨 9.25 g、瓊脂 15 g。將除瓊脂以外的其他成分加熱溶解，再用K2HPO4或KH2PO4 調(diào)節(jié)PH至7.2，加入瓊脂加熱至溶，于121 ℃

29、滅菌15 min，并于無菌室內(nèi)將剛滅完菌，未冷卻的R2A培養(yǎng)基倒入平板待用。在培養(yǎng)基配制完成后，分別按照培養(yǎng)、分離、純化的順序?qū)Υ郎y樣品中的細菌進行研究。</p><p>　　在細菌的培養(yǎng)取過程中首先分別取濃度為10-2,10-3土壤稀釋液各100 μL,分別輕輕均勻涂布到R2A平板上。每個濃度做3個平行，于20℃，倒置培養(yǎng)，每天觀察，觀察一周，使寡營養(yǎng)型細菌在最短時間內(nèi)得到良好的培養(yǎng)環(huán)境。之后于4℃環(huán)境下培養(yǎng)1

30、-2周，從而為南極環(huán)境中嗜寒適冷細菌提供適宜的生長環(huán)境。</p><p>　　在細菌培養(yǎng)過程中每天對平板進行觀察，記錄下單菌落的個數(shù)及生長時間。根據(jù)單菌落的形態(tài)，大小，顏色不同，從平行中挑取單菌落在R2A平板上進行劃線分離。再將劃線所得的單菌落接種于R2A液體培養(yǎng)基中。從而達到分離和純化細菌的目的。</p><p>　?。?）細菌耐藥性檢測</p><p><

31、b>　?、?平板涂布</b></p><p>　　在無菌環(huán)境中，用無菌棉簽從培養(yǎng)容器中蘸取稀釋過的菌液，均勻涂于固體培養(yǎng)基表面，每次旋轉(zhuǎn)平板90°，共涂3次，最后沿平板內(nèi)壁邊緣涂一圈，使整個平板涂布均勻，分別涂布4塊平板。</p><p><b>　　② 藥敏紙片</b></p><p>　　平板放置3到5分鐘，用記

32、號筆和尺子將平板分成均等的4個區(qū)域；用無菌鑷子取4種不同抗生素藥敏紙片，分別貼于平板所劃分好的4個區(qū)域，并輕壓一下紙片，使其貼平。紙片之間相距大約3mm。 一種菌做15種抗生素，4個平板一組，每組菌各個平板抗生素藥敏紙片貼的位置相同，以便觀察結(jié)果。</p><p><b>　　③ 培養(yǎng)觀察</b></p><p>　　將貼好紙片的培養(yǎng)皿8個一組，用保鮮膜包好，放在無光

33、照，20℃恒溫箱培養(yǎng)24～48小時，觀察抑菌圈大小，記錄結(jié)果并且拍照保存。</p><p><b>　?。?）菌落PCR</b></p><p>　　對已知耐藥表型的細菌進行耐藥基因的檢測，檢測過程中利用特異性的PCR引物（表2）直接對細菌模板進行菌液PCR。PCR體系及循環(huán)設(shè)置情況如下：</p><p>　　在0.2 mL EP管中分別加入M

34、ix 25μL、引物F1 1.5μL、引物F2 1.5μL、菌液 2μL、DEPC水 20μL。編號，倒置輕敲使其充分混合，再微離；將EP管放入PCR儀進行基因擴增。94 ℃預變性5 min；主循環(huán)94 ℃ 30s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 循環(huán)36次；終延伸72 ℃ 10 min;10 ℃ 保存。反應結(jié)束后，各取3-5µL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物割膠回收純化的具體步驟依照試劑盒說明書進行操

35、作。</p><p>　　表2 PCR擴增所用引物信息[17]</p><p><b>　?。?）克隆測序</b></p><p>　　PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收純化后，需要進行測序以獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。但是目前利用PCR產(chǎn)物直接進行測序的結(jié)果比較差，也此一般需要對目的基因進行重組克隆后進行測序。</p><p>　　T載體與PC

36、R產(chǎn)物的連接：</p><p>　　1）在微量離心管中配置下列DNA溶液，全量為5µL。pMD18-T 0.5µL，純化的PCR產(chǎn)物4.5µL（目的片段與載體的摩爾量之比為1:3-1:10）</p><p>　　2）加入5µL（等量）的SolutionⅠ</p><p><b>　　3）16℃連接過夜</b&g

37、t;</p><p><b>　　轉(zhuǎn)化及克?。?lt;/b></p><p>　　1）100µL的感受態(tài)細胞，冰上解凍至剛好融化；</p><p>　　2）上述連接產(chǎn)物（全量10µL）加入至100µL DH5α感受態(tài)細胞中冰中放置30分鐘；</p><p>　　3）42℃熱激90秒鐘后，立即冰中放

38、置3min。</p><p>　　4）加入890µL預熱的不含Amp的SOC液體培養(yǎng)基后，37℃搖床培養(yǎng)1-1.5h；</p><p>　　5）4000rpm，室溫離心5min，去上清850，留400µL，剩下吹打均勻；</p><p>　　6）抽取100µL上述混合液均勻涂布到含Amp(100µg/mL)的LB平板上，37℃

39、靜止培養(yǎng)12-14h。</p><p>　　重組質(zhì)粒的提取與鑒定</p><p>　　1）挑取單菌落于含Amp(100µg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)6-8h。</p><p>　　2）取培養(yǎng)液1.5 mL，10000rpm，室溫離心4min，棄去上清，倒置于吸水紙上，使培養(yǎng)液流盡；</p><p>　　2）加入100

40、μL冰預冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，調(diào)pH值至8.0），振蕩混勻，冰浴5min；</p><p>　　3）加入200μL溶液Ⅱ（0.2mol/L NaOH，1%SDS），溫和顛倒數(shù)次，混勻，冰浴5min；</p><p>　　4）加150μL溶液Ⅲ（5mol/L醋酸鉀60mL，冰醋酸11.5mL，ddH2O 28.5m

41、L），上下顛倒混勻，冰浴5min；</p><p>　　5）12000rpm，4℃離心10 min，將水相轉(zhuǎn)至干凈的1.5mL EP管；</p><p>　　6）加入等體積酚/氯仿，上下顛倒混勻，13000rpm，離心6min；</p><p>　　7）將上清移至另一1.5mL EP管中，加入1/10體積的NaAc(pH值5.2)和2倍體積的無水乙醇（使用前均-20

42、℃預冷），充分混勻，室溫放置5min后，13000rpm，4℃離心10min；</p><p>　　8）棄上清，沉淀加1mL 70%乙醇漂洗，13000rpm，4℃，離心6min；棄上清，沉淀于室溫或37℃干燥20-30min，加20μL左右的溶有RNA酶（20µg/mL）的ddH2O，溶解DNA，短暫振蕩或用加樣器上下吹打混勻，37℃作用30min備用；</p><p>　　9

43、）取3-5μL進行1%瓊脂糖電泳。</p><p>　　與空載體比較，選取瓊脂糖電泳速度較慢者進行雙酶切鑒定，建立如下反 應體系：10×buffer 2μL 、SalⅠ 1μL 、EcoR I 1μL 、重組質(zhì)粒 5μL 、加DEPC水至20μL。37℃水浴3h。取3-5μL進行1%瓊脂糖電泳。</p><p>　　10）重組質(zhì)粒的測序鑒定</p><p>

44、;　　將PCR和酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序。</p><p><b>　　（6）序列比對分析</b></p><p>　　本實驗中主要采用ClustalX和Lasergene軟件包中的MegAlign軟件配合NCBI中的Blast軟件完成多重序列比對，比對采用ClustalW的方法進行。</p><p><b&

45、gt;　　3 結(jié)果</b></p><p>　　3.1 細菌的培養(yǎng)、分離與純化</p><p>　　利用R2A培養(yǎng)基對3個采樣點的南極沙土中的細菌進行培養(yǎng)和分離、純化，共計挑取純化獲得純培養(yǎng)72株細菌，其中SOZ1 26株，SOZ2 23株，SOZ3 23株。</p><p><b>　　3.2 耐藥性檢測</b></p>

46、;<p>　　利用24種抗生素對純化的72株細菌進行檢測分離的結(jié)果顯示，在9種抗生素（米若環(huán)素、亞胺培南、慶大霉素、甲氧嘧啶、左氟沙星、頭孢拉定、萘啶酸、利福平、環(huán)丙沙星）中沒有發(fā)現(xiàn)有耐藥性現(xiàn)象，在其它15種抗生素均發(fā)現(xiàn)有不同的耐藥現(xiàn)象。南極沙土中的細菌的耐藥性圖譜如下所示（圖3）。</p><p>　　圖3 南極沙土中的細菌的耐藥性圖譜</p><p>　　3.3 PCR擴

47、增結(jié)果</p><p>　　根據(jù)2.2.4中所提供的反應體系與循環(huán)設(shè)置方法，結(jié)合圖3中細菌耐藥性情況分別利用各自耐藥表現(xiàn)型所對應的引物組合對耐四環(huán)素的13株細菌和耐氨芐青霉素的41株細菌進行了菌液PCR。由于部分細菌具有多重耐藥性，對于這些樣品也同樣進行了多種引物的擴增。下面將分別針對耐四環(huán)素細菌和耐氨芐青霉素細菌的基因擴增結(jié)果進行介紹。</p><p>　　3.3.1 耐四環(huán)素基因的PC

48、R擴增結(jié)果</p><p>　　通過耐藥性圖譜可以發(fā)現(xiàn)，72株南極沙土中的細菌中共有13株具有對四環(huán)素的耐藥性，我們也利用表2中所對應的20對引物分別進行了PCR擴增，部分擴增結(jié)果如以下圖片所示。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計，在利用所有引物對耐四環(huán)素基因進行PCR擴增過程中，共獲得陽性結(jié)果19個。</p><p>　　圖4 引物tet(Q)和tet(W)在耐四環(huán)素細菌中的擴增結(jié)果</p>&l

49、t;p>　　其中M為Marker DL2,000；1-5號點樣孔分別為引物tet（Q）在SOZ2-406、SOZ1-310、SOZ1-618、SOZ1-612和SOZ1-717號細菌樣品中的擴增產(chǎn)物；6-10號點樣孔為引物tet（W）在SOZ2-406、SOZ1-310、SOZ1-618、SOZ1-612和SOZ1-717號細菌樣品中的擴增產(chǎn)物</p><p>　　圖5 引物tet(M)和tet(Q)在耐四

50、環(huán)素細菌中的擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-13號點樣孔分別為引物tet（M）在SOZ2-202、SOZ2-411、SOZ2-413、SOZ3-508、SOZ3-605、SOZ1-607、SOZ1-608、SOZ1-610、SOZ1-612、SOZ1-702、SOZ1-717、SOZ1-718號細菌樣品中的擴增產(chǎn)物；14號點樣孔為引物tet（Q）在SOZ1-310號細菌樣品

51、中的擴增產(chǎn)物</p><p>　　圖6 tet(A)等4種引物在耐四環(huán)素細菌中的擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-24號點樣孔分別是引物tet(A)、tet(B)、tet(E)及tet（H）在SOZ1-610、SOZ1-612、SOZ1-702、SOZ1-703、SOZ1-717、SOZ1-718號細菌樣品中的擴增產(chǎn)物</p><p

52、>　　圖7 引物tet(J)與tet(Z)在耐四環(huán)素細菌中的擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-12號點樣孔分別是引物tet(A)、tet(B)、tet(E)及tet（H）在SOZ1-610、SOZ1-612、SOZ1-702、SOZ1-703、SOZ1-717、SOZ1-718號細菌樣品中的擴增產(chǎn)物</p><p>　　3.3.2 耐氨芐青霉素基

53、因的PCR擴增結(jié)果</p><p>　　利用耐氨芐青霉素細菌檢測所對應的引物4種引物對耐氨芐青霉素基因進行PCR擴增，結(jié)果在引物SHV和CARB中共獲得了22個陽性克隆結(jié)果（見圖8-圖11）。</p><p>　　圖8 引物SHV在耐氨芐青霉素細菌中的PCR擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-24號點樣孔分別是引物SHV在SOZ2

54、-203、SOZ2-207、SOZ2-208、SOZ2-210、SOZ3-211、SOZ3-502、SOZ1-301、SOZ1-309、SOZ1-312、SOZ1-313、SOZ1-314、SOZ1-316、SOZ2-3172、SOZ2-402、SOZ2-406、SOZ2-407、SOZ2-408、SOZ2-410、SOZ2-411、SOZ2-413、SOZ3-505、SOZ2-506、SOZ1-507及SOZ3-510號細菌樣品中的擴

55、增產(chǎn)物</p><p>　　圖9 引物SHV在耐氨芐青霉素細菌中的PCR擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-17號點樣孔分別是引物SHV在SOZ3-512、SOZ3-516、SOZ2-518、SOZ3-520、SOZ2-601、SOZ3-602、SOZ1-603、SOZ1-604、SOZ1-607、SOZ1-609、SOZ1-610、SOZ3-701、S

56、OZ1-703、SOZ1-704、SOZ1-706、SOZ1-709及SOZ1-717號細菌樣品中的擴增產(chǎn)物；18號點樣孔為陰性對照</p><p>　　圖10 引物CARB在耐氨芐青霉素細菌中的擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000; 1-12號點樣孔分別是引物CARB在SOZ2-203、SOZ2-207、SOZ2-208、SOZ2-210、SOZ3-211、

57、SOZ3-502、SOZ1-301、SOZ1-309、SOZ1-312、SOZ1-313、SOZ1-314及SOZ1-316號細菌樣品中的擴增結(jié)果</p><p>　　圖11 引物CARB在耐氨芐青霉素細菌中的擴增結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000; 1-12號點樣孔分別是引物CARB在SOZ2-317、SOZ2-411、SOZ3-505、SOZ2-506、SO

58、Z1-507、SOZ3-510、SOZ3-512、SOZ3-516、SOZ2-518、SOZ3-520及SOZ1-706號細菌樣品中的擴增結(jié)果</p><p>　　3.3.3 重組質(zhì)粒的鑒定</p><p>　　重組質(zhì)粒的提取結(jié)果以及雙酶切鑒定結(jié)果如圖9和10所示。由圖中所示電泳情況可以得知，重組克隆為攜帶有目的片段的陽性克隆，可以進行測序。</p><p>　　圖

59、9 質(zhì)粒電泳示意圖</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-6為6個質(zhì)粒樣品</p><p>　　圖10 雙酶切鑒定結(jié)果</p><p>　　其中M為Marker DL2,000；1-6為相應的質(zhì)粒酶切結(jié)果</p><p>　　3.3.4 測序驗證結(jié)果</p><p>　　通過上述幾種檢測的初步結(jié)

60、果，對經(jīng)PCR擴增及質(zhì)粒酶切驗證所獲得的陽性樣品進行測序檢測，并根據(jù)測序結(jié)果進行多重序列比對分析，從而確定各耐藥性細菌的耐藥基因型。具體測序驗證結(jié)果如下：</p><p>　　（1）耐四環(huán)素細菌的基因型</p><p>　　通過PCR擴增檢測共在耐四環(huán)素細菌中獲得19個陽性結(jié)果，其中也包含同一細菌樣品同時檢測出兩種基因型的結(jié)果，如SOZ1-7172號樣品同時檢測出tet(Q)和tet(W)

61、的耐藥基因型。通過測序驗證，對其中部分假陽性結(jié)果進行了排除并最終確定了耐四環(huán)素細菌的耐藥基因型（表3）。從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，通過PCR克隆測序的方法檢測確定了耐四環(huán)素南極沙土樣中可培養(yǎng)細菌9株細菌的耐藥基因型，其中tet（Q）型2株，tet（W）型1株，tet（B）型6株，各基因型的檢出率如圖11所示。</p><p>　　表3 耐四環(huán)素細菌的耐藥基因型檢測結(jié)果</p><p>　　其中

62、“＋”為陽性，“-”為陰性</p><p>　　圖11 耐四環(huán)素細菌基因型的檢出率</p><p>　?。?）耐氨芐青霉素細菌的基因型</p><p>　　與耐四環(huán)素細菌的檢測相似，通過對耐氨芐青霉素細菌進行的PCR檢測共獲得22個陽性結(jié)果，對這些陽性結(jié)果加以測序驗證發(fā)現(xiàn)其中CARB引物的4個檢出結(jié)果全部為假陽性從而確定了其余18個樣品屬于SHV型耐氨芐青霉素細菌。

63、具體菌株信息如表4所示，從統(tǒng)計結(jié)果可以看出，在諸多具有耐氨芐青霉素表現(xiàn)型的南極沙土中的細菌中只檢測到了18株SHV型細菌，檢出率為81.82%，雖然通過PCR擴增得到了4株CARB型細菌，但是通過測序分析證實這4株實際上并非真正的CARB型細菌，同時也未發(fā)現(xiàn)有TEM型細菌存在。兩種耐氨芐青霉素細菌基因型的檢出率如圖12所示。</p><p>　　表4 耐氨芐青霉素細菌的耐藥基因型檢測結(jié)果</p>

64、<p>　　其中“＋”為陽性，“-”為陰性</p><p><b>　　4 分析與討論</b></p><p>　　4.1 三個站點細菌耐藥性的比較</p><p>　　本文通過對南極中山站三個采樣點的細菌進行培養(yǎng)、耐藥性及耐藥基因型的檢測，發(fā)現(xiàn)了三個南極站點細菌間的部分特征存在一定的差異。首先，本文利用R2A培養(yǎng)基對三個站點樣品進行

65、培養(yǎng)的結(jié)果顯示SOZ1的細菌數(shù)目要遠遠多于SOZ2和SOZ3。而從耐藥性的角度講，雖然三個站點在耐藥性種類上并無明顯差別，但是在耐藥細菌的數(shù)量和多重耐藥性上有一定的差異。從耐藥性圖譜中也可以看出，SOZ1的細菌耐藥性總數(shù)要遠遠多于其他兩個站點的細菌樣品，在細菌樣品數(shù)量基本一致的前提下，這說明與其他站點相比SOZ1細菌樣品中具有耐藥性的細菌比例和細菌多重耐藥性比例更高。以青霉素耐藥性為例，SOZ3的青霉素耐受比例僅為9%，而SOZ1和SO

66、Z2則均高于30%（圖13）。</p><p>　　由于環(huán)境中抗生素的濃度增加，細菌的選擇壓力也不斷增大，從而導致了抗生素耐藥性細菌和耐藥基因的出現(xiàn)和傳播，這也是抗生素抗性基因污染的理論基礎(chǔ)之一[18]。除了誘導產(chǎn)生抗生素抗性基因外，自然界本身存在的抗性基因也可能隨著基因轉(zhuǎn)移單位在細菌中傳播并自我復制而保留下來。</p><p>　　因此我們推測，可能造成三個站點細菌差異的原因有兩個。其一

67、是通過傳播渠道，譬如各種飛禽和水生動物等，隨著人類使用抗生素數(shù)量的增加，這些動物接觸抗生素的機會也大大增加，他們所攜帶的細菌耐藥性也不斷增強，在向南極遷徙運動過程中，細菌中的耐藥基因也得到了傳播[19]。自然對于更加靠近其他南半球大陸而遠離南極點的站點而言，這種機會也更大。此外，我們認為出現(xiàn)三個站點細菌耐藥性差異的一個重要原因便是人類活動的影響[20]。從表1也可以看出，人類活動對于三個站點的影響程度也不盡相同。SOZ1位于與人類生產(chǎn)生

68、活具有密切聯(lián)系的排污口處，SOZ2位于站區(qū)內(nèi)的直升機停機坪旁，而SOZ3則位于人跡罕至的石縫中，相比之下人類活動對于三個采樣點的影響由SOZ1至SOZ3遞減。在人類醫(yī)療等活動中，抗生素的使用對南極環(huán)境造成了污染，并誘導產(chǎn)生了抗生素污染。</p><p>　　4.2 β-內(nèi)酰胺類耐藥細菌基因分析</p><p>　　β-內(nèi)酰胺類抗生素是一類具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，主要包括青霉素類和頭孢類兩

69、大類。青霉素通過與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合抑制細菌細胞壁的形成從而達到殺菌的目的。隨著該類抗生素的使用，也出現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類耐藥性細菌，細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性主要是通過編碼β-內(nèi)酰胺酶實現(xiàn)的，它可以將青霉素等抗生素水解從而達到抗藥的效果[21]。本文也圍繞南極沙土中的細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性進行了分析，結(jié)果在三個站點中均發(fā)現(xiàn)了β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性細菌的存在[22]。但是通過藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，三個站點對氨芐青霉素的耐受比例也存在

70、差異。其中SOZ3中也有多株細菌具有β-內(nèi)酰胺類耐藥性，這說明在沒有外界抗生素壓力的環(huán)境中也依然存在β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因[23]。而SOZ1和SOZ2對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受比例要遠遠高于SOZ3，這也再次證實了人類活動對細菌耐受性出現(xiàn)的影響。</p><p>　　根據(jù)耐藥性機制和耐藥基因型的不同，β-內(nèi)酰胺類耐藥細菌又分為TEM型、SHV型等。其中TEM型和SHV型均屬于質(zhì)粒介導的，TEM類和SHV類E

71、SBLs也最為常見。TEM類是由TEM-1、TEM-2活性部位的一個或多個氨基酸置換衍生而來，而SHV類，是由SHV-1進化而來，同TEM相似度較高[24]。本文通過一對特異性引物對耐青霉素細菌的基因型進行檢測，并只檢測得到了SHV型的耐藥性細菌。這說明南極沙土中的細菌對氨芐青霉素的耐藥性是通過所攜帶的含SHV基因的質(zhì)粒編碼特定的β-內(nèi)酰胺酶達到的。</p><p>　　近年來，隨著β-內(nèi)酰胺類耐藥性細菌的增加，

72、也在部分細菌中出現(xiàn)了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases, ESBLs）的問題，針對該問題也出現(xiàn)了第三代頭孢菌素和氨曲南等藥品[25]。頭孢哌酮便是第三代頭孢菌素的一種，但是通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)目前在南極沙土中的細菌樣品中只有極為少數(shù)的耐該類藥物的細菌存在。且這些細菌只存在于SOZ1和SOZ2中，目前尚未在SOZ3中發(fā)現(xiàn)。這也可能是人類活動尚未影響該地的一種表現(xiàn)。</p>&l

73、t;p>　　圖13 三個站點氨芐青霉素耐受比例分析</p><p>　　4.3 耐四環(huán)素類細菌基因型分析</p><p>　　四環(huán)素類抗生素是在結(jié)構(gòu)上具有并四苯環(huán)骨架的一類抗生素藥物，自從上世紀40年代被發(fā)現(xiàn)以來，四環(huán)素便作為一種常用的廣譜類抗生素使用[26]。四環(huán)素類抗生素可以阻止氨酰-tRNA與核糖體結(jié)合位點結(jié)合從而阻止細菌蛋白質(zhì)合成的抗生素。隨著四環(huán)素類抗生素不合理應用現(xiàn)象的增

74、加，導致耐藥菌及耐藥現(xiàn)象不斷的變異和增加[27]。從細菌耐藥機制的角度講，細菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥機制主要包括主動外輸?shù)鞍?、核糖體保護蛋白、四環(huán)素滅活或鈍化酶及16S rRNA基因突變影響與四環(huán)素結(jié)合四種[28]。根據(jù)上述機制的不同，耐四環(huán)素類細菌基因型也不盡相同，例如常見的tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(E)、tet(G)等類型屬于外排蛋白類，具有這種基因型的細菌可以編碼產(chǎn)生單一特異性的外排蛋白，并將

75、四環(huán)素與金屬離子的復合物通過外排的方式排出細菌體外，實現(xiàn)耐藥性。而tet(M)、tet(O)、tet(B)/P、OTR等類型則通過編碼核糖體保護蛋白，促使已結(jié)合的四環(huán)素移位及縮短游離四環(huán)素半衰期的方式實現(xiàn)其耐藥性[29]。</p><p>　　利用克隆測序的方法對耐四環(huán)素細菌的基因進行檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，南極沙土中的細菌中存在3種不同的四環(huán)素耐藥基因型，且這三類基因型的站點分布具有一定的特點（圖14）。從基因型與站點

76、的分布可以看出，tet(B)型細菌在耐四環(huán)素細菌中所占的比例最高，這說明南極沙土中的細菌對四環(huán)素的耐藥性大多是通過主動外輸?shù)鞍椎姆绞綄崿F(xiàn)的。同時，我們也發(fā)現(xiàn)tet(W)型和tet(Q)型分別只在站點2和站點1中存在。Tet(W)型與tet(Q)型均是利用核糖體保護蛋白機制達到耐藥性，但是兩個站點基因型的不同且并不在其它站點出現(xiàn)說明具有該種基因型的細菌尚未傳播至另外的站點。</p><p>　　圖14 耐四環(huán)素細菌

77、的基因型與站點分布情況</p><p>　　4.4 南極沙土中的細菌與其他陸源細菌耐藥基因型的比較</p><p>　　養(yǎng)殖動物腸道中的抗性菌株是環(huán)境中抗生素抗性基因的主要來源。微生物通過質(zhì)粒等媒介交換水平轉(zhuǎn)移基因從而傳播抗性基因[30]。環(huán)境中的抗生素水平基本沒有環(huán)境風險，目前已有16種四環(huán)素類抗性基因，10種β-內(nèi)酰胺類抗性基因在廢水、河流、污水處理廠、土壤、空氣等環(huán)境介質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)[3

78、1]。曾研究發(fā)現(xiàn)，人為活動干擾的環(huán)境介質(zhì)中抗性基因濃度明顯高于未受到人類干擾地區(qū)[32]。</p><p>　　與其他普通陸源細菌相比，南極沙土中的細菌具有自身獨特的環(huán)境特點，它們的生存環(huán)境與普通陸源細菌相比更為復雜和殘酷，同時相對來說受到人類活動的影響也小一些，與其它陸源細菌間的基因交流也相對較少[33]。這種環(huán)境條件也造成了南極沙土中的細菌與普通陸源細菌相比在耐藥性方面呈現(xiàn)出一定的特點。</p>

79、<p>　　首先，在對常用的普通抗生素，如四環(huán)素、氨芐青霉素等β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性方面，南極沙土中的細菌的耐藥性受人類活動的影響顯著。在人類活動較為頻繁的區(qū)域，其細菌的耐藥性與普通陸源細菌極為相似，但是對于人之罕至的地區(qū)而言，這種耐藥性也要更低一些[34]。</p><p>　　此外，對于新型抗生素類藥物，如第三代頭孢菌素等的耐藥性方面，南極沙土中的細菌的耐藥性要顯著低于其他陸源細菌[35]。這

80、是因為對其他陸源細菌所面臨的抗生素選擇壓力大，誘導產(chǎn)生的耐藥基因也相對較多。這種陸源耐藥基因的產(chǎn)生與醫(yī)療環(huán)境中的抗生素的大量使用有著直接的聯(lián)系[36]。通過本研究也可以看出，我們只在頭孢哌酮中發(fā)現(xiàn)了5株耐藥細菌，且在SOZ3中并未發(fā)現(xiàn)該抗生素的耐藥細菌。這說明與其他陸源細菌相比，南極沙土中的細菌的耐藥性顯得更為滯后，其耐藥基因的進化也更慢。</p><p><b>　　5 結(jié)論</b><

81、;/p><p>　　本文通過對南極沙土中的細菌的分離、純化以及其耐藥性的表現(xiàn)型和基因型研究，主要獲得了以下結(jié)論：</p><p>　　（1）人類活動對南極環(huán)境造成了一定的影響并誘導了細菌耐藥性的增強，同時本研究也再次證實在沒有外界抗生素壓力的原始環(huán)境中耐藥現(xiàn)象和多重耐藥仍然存在。</p><p>　?。?）南極極端環(huán)境中存活的細菌具有多種耐藥性，并且多株細菌存在多重耐藥

82、性等現(xiàn)象。</p><p>　?。?）即使對于具有同種耐藥表現(xiàn)型的細菌，其耐藥基因型也不盡相同，對闡述其耐藥機制提供了基礎(chǔ)和依據(jù)。</p><p>　　隨著各種極地活動的增加，南極原始的生態(tài)環(huán)境也面臨著越來越多的威脅，雖然近年來國內(nèi)外研究人員也針對極地環(huán)境、極地微生物的多樣性和極地微生物的耐藥性進行了諸多相關(guān)研究，但是現(xiàn)狀仍不容樂觀[37]。本論文從細菌耐藥性的角度出發(fā)考察了人類科考活動對

83、南極中山站周邊土壤環(huán)境微生態(tài)的影響，為進一步的研究和南極生態(tài)環(huán)境的保護提供了基礎(chǔ)。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 龐小平, 王自磐, 鄂棟臣. 南極生態(tài)環(huán)境分類及其脆弱性分析[J].測繪與空間地理信息, 2006, 29(6): 1-8.</p><p>　　[2] Carpenter, E. J.,

84、 Lin, S., Capone, D. G.. Bacterial activity in South Pole snow[J].Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(10): 4514-4517.</p><p>　　[3] Xiao, X., Yin, X., Lin, J., et al. Chitinase genes in lake sedi

85、ments of Ardley Island, Antarctica[J].Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 7904-7909.</p><p>　　[4] Chong, C., Annie Tan, G., Wong, R. C. S., et al. DGGE fingerprinting of bacteria in soils f

86、rom eight ecologically different sites around Casey Station, Antarctica[J].Polar Biology, 2009, 32(6): 853-860.</p><p>　　[5] Saul, D., Rodrigo, A., Reeves, R., et al. Phylogeny of twenty Thermus isolates con

87、structed from 16S rRNA gene sequence data[J].International journal of systematic bacteriology, 1993, 43(4): 754-760.</p><p>　　[6] 周啟星, 羅義, 王美娥. 抗生素的環(huán)境殘留, 生態(tài)毒性及抗性基因污染[J].生態(tài)毒理學報, 2007.</p><p>　　[7

88、] 吳柄, 喬敏, 朱永官 豬場土壤中 5 種四環(huán)素抗性基因的檢測和定量[J].生態(tài)毒理學報, 2009, 4(5): 705.</p><p>　　[8] Luo, Y., Mao, D., Rysz, M., et al. Trends in Antibiotic Resistance Genes Occurrence in the Haihe River, China[J].Environmental sc

89、ience & technology, 2010, 44(19): 7220-7225.</p><p>　　[9] Mindlin, S., Soina, V., Petrova, M., et al. Isolation of antibiotic resistance bacterial strains from Eastern Siberia permafrost sediments[J].Rus

90、sian Journal of Genetics, 2008, 44(1): 27-34.</p><p>　　[10] Pruden, A., Pei, R., Storteboom, H., et al. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: studies in northern Colorado[J].Environmental sci

91、ence & technology, 2006, 40(23): 7445-7450.</p><p>　　[11] Mindlin, S., Kholodii, G., Gorlenko, Z., et al. Mercury resistance transposons of Gram-negative environmental bacteria and their classification[J

92、].Research in microbiology, 2001, 152(9): 811-822.</p><p>　　[12] Allen, H. K., Moe, L. A., Rodbumrer, J., et al. Functional metagenomics reveals diverse β-lactamases in a remote Alaskan soil[J].The ISME jour

93、nal, 2008, 3(2): 243-251.</p><p>　　[13] D’costa, V. M., King, C. E., Kalan, L., et al. Antibiotic resistance is ancient[J].Nature, 2011, 477(7365): 457-461.</p><p>　　[14] Knapp, C. W., Dolfing,

94、J., Ehlert, P. A. I., et al. Evidence of increasing antibiotic resistance gene abundances in archived soils since 1940[J].Environmental science & technology, 2009, 44(2): 580-587.</p><p>　　[15] Chattopad

95、hyay, M., Jagannadham, M.. Maintenance of membrane fluidity in Antarctic bacteria[J].Polar Biology, 2001, 24(5): 386-388.</p><p>　　[16] Bowman, J. P., Mccammon, S. A., Brown, M. V., et al. Diversity and asso

96、ciation of psychrophilic bacteria in Antarctic sea ice[J].Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(8): 3068-3078.</p><p>　　[17] Hu ,J.Y., Shi, J.C., Chang, H., et al..Phenotyping and Genotyping of An

97、tibiotic-Resistant Escherichia coli Isolated from a Natural River Basin[J]. Environ. Sci. Technol, 2008, 42:3415–3420.</p><p>　　[18] Mullany P., Mevius D., Guerra B., et al.. Acquired antibiotic resistance g

98、enes:an overview[J].frontiers in Microbiology, 2011,10:.3389.</p><p>　　[19] Davies J., Davies D.. Origins and Evolution of Antibiotic Resistance[M]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2010:417–433.

99、</p><p>　　[20] Jalbert, I., Willcox, M. D. P. & Sweeney, D. F. Isolation of Staphylococcus aureus from a contact lens at the time of a contact lens-induced peripheral ulcer: case report[J].Cornea, 2000,

100、19(1): 116.</p><p>　　[21] 張永利, 顧怡明, 張杰, 等. 多重耐藥陰溝腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶編碼基因的研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志, 2004, 14(5): 481-484.</p><p>　　[22] 李蓉. 耐藥性細菌的篩選及產(chǎn)ESBLs鮑曼不動桿菌耐藥基因的研究[D].南昌大學醫(yī)學院博士學位論文,2006:71-88.</p><p

101、>　　[23] D'costa, V. M., Mcgrann, K. M., Hughes, D. W., et al. Sampling the antibiotic resistome[J].Science, 2006, 311(5759): 374-377.</p><p>　　[24] Davies, J.. Origins and evolution of antibiotic resi

102、stance[J].Microbiologia (Madrid, Spain), 1996, 12(1): 9.</p><p>　　[25] 魏松林. 抗生素污染土壤細菌生態(tài)學及其耐藥性研究[D]. 揚州大學碩士學位論文,2008:69-78.</p><p>　　[26] Thiele‐Bruhn, S. Pharmaceutical antibiotic compounds in s

103、oils–a review[J].Journal of Plant Nutrition and Soil Science, 2003, 166(2): 145-167.</p><p>　　[27] Davies, J. Microbes have the last word. A drastic re-evaluation of antimicrobial treatment is needed to over

104、come the threat of antibiotic-resistant bacteria[J].EMBO reports, 2007, 8(7): 616.</p><p>　　[28] Enright, M. C. The evolution of a resistant pathogen-the case of MRSA[J].Current opinion in pharmacology, 2003

105、, 3(5): 474-479.</p><p>　　[29] De La Torre, J. R., Christianson, L. M., Béjà, O., et al. Proteorhodopsin genes are distributed among divergent marine bacterial taxa[J].Proceedings of the National A

106、cademy of Sciences, 2003, 100(22): 12830.</p><p>　　[30] Schwarz, S., Kehrenberg, C., Doublet, B., et al. Molecular basis of bacterial resistance to chloramphenicol and florfenicol[J].FEMS microbiology review

107、s, 2004, 28(5): 519-542.</p><p>　　[31] Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].Molecular biology and evolution, 2007, 24(8): 159