大腸桿菌耐藥基因acrB、marR的克隆與表達(dá)菌株的初步篩選.pdf

1、由于在治療大腸桿菌病過程中的抗生素頻繁、廣泛及不合理應(yīng)用，導(dǎo)致大腸桿菌多重耐藥的現(xiàn)象日益嚴(yán)重，大腸桿菌對(duì)多種抗生素耐藥主要與菌體中存在的外輸泵有關(guān)。一般認(rèn)為AcrAB-TolC外輸泵是最主要的外輸系統(tǒng)，若使該系統(tǒng)失活，大腸桿菌可從多重耐藥狀態(tài)變?yōu)橄鄬?duì)敏感狀態(tài)。對(duì)大腸桿菌轉(zhuǎn)運(yùn)基因acrB及其多重耐藥操縱抑制基因marR的研究對(duì)深入研究大腸桿菌的耐藥機(jī)制具有重要意義。 本論文采用常規(guī)方法提取大腸桿菌藥敏質(zhì)控株ATCC25922及5株

2、動(dòng)物源性不同、耐藥水平不同的臨床分離多重耐藥大腸桿菌的acrB、marR基因的染色體DNA，通過其特異性引物的設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD-18T的連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)中以及對(duì)酶切及PCR鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒序列測(cè)定，獲得了受試菌的acrB、marR全基因序列。測(cè)序結(jié)果表明，所測(cè)得的3株不同動(dòng)物源性大腸桿菌的acrB基因的核苷酸序列與GeneBank中發(fā)表的該基因核苷酸序列的同源性為100％；除1

3、株耐藥菌的marR基因未發(fā)生突變外，其余的部分堿基均發(fā)生了突變，個(gè)別氨基酸也發(fā)生了變化。與GeneBank中發(fā)表的該基因序列對(duì)比分析，核苷酸序列的同源性在97.5％-98.2％之間，氨基酸序列的同源性在97.3％-98.6％，其中包括兩處共同突變：307位G→A，氨基酸Gly→Ser；409位T→C，氨基酸Try→His。其中雞源高耐藥株的核苷酸突變位點(diǎn)最多。上述耐藥株的marR基因突變位點(diǎn)是否影響了marR對(duì)AcrAB-TolC外輸泵

4、的調(diào)控作用，進(jìn)而影響其多重耐藥水平，還有待于進(jìn)一步研究。 在對(duì)acrB、marR基因進(jìn)行克隆及同源性比較分析的基礎(chǔ)上，通過對(duì)克隆質(zhì)粒以及表達(dá)載體質(zhì)粒pPICZαA的雙酶切、酶切回收產(chǎn)物的連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli TOP10感受態(tài)中、重組質(zhì)粒pPICZαA-acrB和pPICZαA-mar的酶切及PCR鑒定、表達(dá)重組質(zhì)粒pPICZαA-acrB和pPICZαA-marR經(jīng)SacⅠ酶線性化、線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至GS115酵母感

5、受態(tài)細(xì)胞中，煮-凍-煮法提取重組酵母基因組，PCR法進(jìn)行陽性基因整合酵母的篩選，1％瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示acrB、marR基因已整合入GS115染色體上，PCR產(chǎn)物的分子量分別約為1.6Kb、1.0Kb。 本試驗(yàn)獲得的臨床分離大腸桿菌耐藥基因acrB、marR的核苷酸序列同源性比較分析結(jié)果，可為深入研究其AcrAB-TolC外輸泵的調(diào)控機(jī)制提供參考；初步篩選出acrB、marR基因的畢赤酵母表達(dá)菌株，將為進(jìn)一步誘導(dǎo)其在畢赤酵母