豬GDF11多克隆抗體的制備、前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)及誘導分化研究.pdf

1、本文分為兩個研究方向：豬GDF11蛋白表達產(chǎn)物的純化及其多克隆抗體的制備與檢測和豬前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)及誘導分化。 第一部分：原核表達蛋白的純化及多克隆抗體制備及檢測 生長分化因子11(GDF11)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族、Myostatin/GDF11亞家族的一種分泌蛋白。GDF11的表達水平可能與豬的胸腰椎數(shù)的多少有關。為了分析GDF11在不同胸腰椎數(shù)的豬品種中的表達差異，獲得該蛋白的抗體十分必要。

2、 將重組原核表達質(zhì)粒pGEX-6P-1-GDF11經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I雙酶切，將回收的GDF11酶切片段插入原核表達載體pGEX-4T-2中，獲得重組原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2-GDF11。重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并經(jīng)異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導產(chǎn)生了65KDa的GST-GDF11融合蛋白。融合蛋白以包涵體的形式存在，經(jīng)稀釋復性和凝血酶酶切，分離純化出42 KDa左右

3、的GDF11蛋白，SDS-PAGE分離純化出GDF11蛋白。 純化的GDF11蛋白注射小鼠，取其血清獲得抗GDF11蛋白的多克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測其滴度最高可達1：25600。經(jīng)Western印跡的結(jié)果表明，制備的多克隆抗體對LLC-PK1細胞內(nèi)GDF11蛋白具有較高的特異性，是進一步研究GDF11表達調(diào)控機制和功能的基礎。 第二部分：豬前體脂肪細胞的分離培養(yǎng)及誘導分化 脂肪沉積性狀是豬的重要經(jīng)濟性狀，與豬肉

4、品質(zhì)及其經(jīng)濟價值緊密聯(lián)系。萊蕪豬的肌間脂肪含量比其他品種都要高，研究其脂肪沉積有重要的意義。脂肪細胞在體外很難培養(yǎng)；而脂肪組織中的前脂肪細胞在體外可以培養(yǎng)，在一定條件下可誘導分化為脂肪細胞。 本研究從三日齡萊蕪豬的背部皮下獲得皮下脂肪，經(jīng)膠原酶消化，分離培養(yǎng)了萊蕪豬的前體脂肪細胞。前體脂肪細胞融合后的第二天，用胰島素和地塞米松誘導分化，經(jīng)誘導分化獲得成熟脂肪細胞。在顯微鏡下觀察細胞分化前后的形態(tài)，前體脂肪細胞呈纖維樣；成熟的脂肪