蛋白質(zhì)組學技術(shù)研究甲基對硫磷脅迫下扇貝消化和腎組織的差異表達蛋白質(zhì).pdf

1、甲基對硫磷(methyl parathion,MP)是我國生產(chǎn)和使用量最大的有機磷農(nóng)藥(OPP)之一,影響范圍廣,毒性高,是極具代表性的有機磷污染物。MP的過量使用,已對水生生物的生存乃至人類健康構(gòu)成了一定威脅。目前,對于OPP的毒性機制研究還主要側(cè)重于對少數(shù)幾種酶的研究,研究方法更多還是采用傳統(tǒng)的終點法,而在蛋白質(zhì)組水平上進行OPP毒理學研究的報道還相對較少。本論文以蝦夷扇貝為研究對象,以急性和慢性濃度的MP為途徑脅迫扇貝,研究其腎組

2、織和消化腺的差異表達蛋白質(zhì)。
　　 為了建立急性和慢性MP脅迫的分析模型,我們對96h半致死濃度(LC50)、扇貝的SOD活性、AchE活性以及MP殘留等傳統(tǒng)指標進行了測定。Bliss法計算得到的96h LC50為4.59 mg/L。而在1 mg/L和50μg/L的MP濃度下,扇貝腎組織和消化腺中都有明顯的MP蓄積現(xiàn)象,蓄積程度隨暴露時間延長而增加。此外,在1 mg/L MP濃度下,肌肉中AchE活性受到了明顯的抑制,而腎組織和

3、消化腺中的SOD活性則呈現(xiàn)“先上升后下降”的趨勢。在此基礎(chǔ)上,我們選用1mg/L,48 h和2.5mg/L,48 h作為MP急性脅迫下蛋白質(zhì)組學研究的兩個端點,而選用50μg/L,14 d和50μg/L21 d作為MP慢性脅迫的兩個端點。運用常規(guī)蛋白質(zhì)組學和膜蛋白質(zhì)組學方法,我們在腎組織和消化腺中共篩選和鑒定了79個差異蛋白。在急性MP脅迫下腎組織中篩選了26個差異蛋白,其中有12個蛋白下調(diào),10個蛋白上調(diào);在慢性MP脅迫下腎組織中有1

4、7個差異蛋白,其中有8個下調(diào),7個上調(diào);而在慢性MP脅迫下消化腺中有36個差異蛋白,其中有7個下調(diào),17個上調(diào)。運用生物信息學方法預測差異蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMR)、疏水性(GRAVY)和細胞定位,結(jié)果表明,這些差異蛋白有很多是胞漿蛋白,而真正的膜內(nèi)在蛋白并不多。我們從上述三組雙向電泳數(shù)據(jù)中共選擇了38種差異蛋白,運用real-time PCR方法對其表達水平進行分析,發(fā)現(xiàn)有些蛋白mRNA水平變化趨勢與雙向電泳所顯示的實驗結(jié)果相似,而有

5、些蛋白卻表現(xiàn)出相反的結(jié)果。進一步用Western blotting分析其中兩個蛋白-β-MPP和α-tubulin的表達水平,發(fā)現(xiàn)β-MPP的表達變化與雙向電泳一致;而α-tubulin在不同的細胞亞組分中卻呈現(xiàn)出不同的蛋白豐度。以上結(jié)果表明,有些差異蛋白在細胞中可能受到不同方式的調(diào)控,導致蛋白的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白豐度的變化呈現(xiàn)出不一致性。
　　 對差異蛋白的功能分析表明,這些蛋白涉及了包括氧化應激、線粒體功能、細胞骨架動力學、細胞

6、適應、信號轉(zhuǎn)導、細胞周期、蛋白合成、物質(zhì)代謝、滲透平衡、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫等多種細胞生理功能,這說明MP對細胞的毒性作用機制是及其復雜的。
　　 由于MPP在進化中的高保守性和在上述實驗中表現(xiàn)出的可信度,我們認為MPP可能成為一種潛在的能夠監(jiān)測OPP污染的生物標志物。我們運用RACEPCR技術(shù)擴增出MPP beta亞基的全長cDNA序列,并用MEGA4.0軟件構(gòu)建一個簡單的MPP系統(tǒng)進化樹。結(jié)果證實,MPP在真核生物,尤其是脊椎動