運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究結(jié)腸組織、腺瘤與腺癌組織的差異表達(dá)蛋白.pdf

1、中山大學(xué)博士學(xué)位論文運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究結(jié)腸組織、腺瘤與腺癌組織的差異表達(dá)蛋白姓名：崔冀申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：汪建平20080520中山大學(xué)博士學(xué)位論文運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究結(jié)腸組織、腺瘤與腺癌組織的差異表達(dá)蛋白我們先通過(guò)對(duì)手術(shù)時(shí)獲取的結(jié)腸癌組織標(biāo)本進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。以不同實(shí)驗(yàn)參數(shù)，即蛋白質(zhì)裂解液體積比、蛋白質(zhì)沉淀提取等方法提取結(jié)腸癌組織總蛋白質(zhì)，采用24cm、Ph4—7的IPG膠條進(jìn)行第一向等電聚焦，125％的SDSPA

2、GE進(jìn)行第二向電泳分離蛋白后，用分析軟件對(duì)圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在組織和蛋白質(zhì)裂解液的質(zhì)量體積比為l：10，用丙酮結(jié)合無(wú)水乙醇法清洗蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)上樣量100pg，得到的結(jié)腸癌總蛋白質(zhì)的雙向電泳圖像重復(fù)性好，顯示蛋白質(zhì)分離清晰，沒(méi)有明顯的條帶。在此基礎(chǔ)上，我們利用得到的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)正常結(jié)腸組織、結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸腺癌提取總蛋白，并進(jìn)行膠內(nèi)差異雙向電泳分離，電泳后的凝膠用CyDye進(jìn)行染色，圖像掃描后應(yīng)用分析軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分析，建立正

3、常組織、腺瘤組織、腺癌組織的蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜。我們發(fā)現(xiàn)兩兩間差異表達(dá)變化超過(guò)2倍的蛋白點(diǎn)有31個(gè)。在此基礎(chǔ)上，采用自動(dòng)凝膠采樣系統(tǒng)對(duì)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行自動(dòng)采集，應(yīng)用特異性的胰酶消化蛋白質(zhì)，酶解后的肽段用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI—TOF—MS)進(jìn)行分析，對(duì)獲得的原始數(shù)據(jù)通過(guò)SEQUEST軟件搜索SwISSPROT的人非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，在31個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中，鑒定了24個(gè)蛋白質(zhì)，其中Be協(xié)Tropomyos

4、in(TMp)首次發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸腺癌組織表達(dá)明顯下降。從功能分析，這些差異蛋白質(zhì)與癌細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化、轉(zhuǎn)移等相關(guān)。為了保證初篩結(jié)果的可信、進(jìn)一步研究差異表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)趨勢(shì)，并探討差異表達(dá)蛋白BetaTropomyosin(TMp)、Transglin(SM22)在結(jié)腸癌的表達(dá)情況及在疾病發(fā)展中的作用，我們運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡方法(Westem—Blot)檢測(cè)它們?cè)谡＝M織、腺瘤、腺癌中的相對(duì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常結(jié)腸組織相比，腺瘤組