膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在甲基對硫磷脅迫下海兔胸膜足神經(jīng)節(jié)表達(dá)的差異蛋白質(zhì).pdf

1、甲基對硫磷(Methyl parathion，MP)是常見的有機(jī)磷農(nóng)藥之一，具有藥效高、品種防治對象多等特點(diǎn)，并曾是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用最為廣泛的一類殺蟲劑。連續(xù)監(jiān)測流動水體中有機(jī)磷農(nóng)藥的污染程度及其危害性是目前我國環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域中亟待解決的重大科學(xué)問題之一。監(jiān)控有機(jī)磷農(nóng)藥污染程度的常見方法有化學(xué)法、生物法和物理法，其中組織酶活性和殘留量分析為最常用的監(jiān)控方法，近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也陸續(xù)應(yīng)用于篩選與鑒定適合監(jiān)控有機(jī)磷農(nóng)藥污染的蛋白

2、標(biāo)志物。
　　 本文采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)測定海兔在不同時間、不同濃度的MP脅迫前后，海兔各神經(jīng)節(jié)中MP的殘留量及變化趨勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MP在海兔胸膜足神經(jīng)節(jié)，腦神經(jīng)節(jié)，神經(jīng)連索中均有殘留，在MP暴露的第7天，殘留量達(dá)到最高，而在第14天則降至較低水平并趨于穩(wěn)定。胸膜足神經(jīng)節(jié)中的MP殘留量要低于其他神經(jīng)節(jié)，推測該神經(jīng)節(jié)可能有不同防御MP侵襲的機(jī)制。因而，以海兔胸膜足神經(jīng)節(jié)作為研究素材，選擇7天和14天為兩個觀察點(diǎn)；采用膜蛋

3、白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定在不同濃度MP脅迫下，海兔胸膜足神經(jīng)節(jié)表達(dá)的差異蛋白，并從中篩選出一些有意義的蛋白指示物，并適合于監(jiān)控MP產(chǎn)生的污染程度和揭示MP的毒性機(jī)理。
　　 有機(jī)磷農(nóng)藥可通過產(chǎn)生氧自由基，破壞或改變細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，從而對生物體造成氧化損傷。本研究中，選擇兩種與抗氧化有關(guān)的酶蛋白作為指示物，即超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)，用于研究MP對細(xì)胞氧化系統(tǒng)的影響，并選用乙酰膽堿酯酶(AChE)作為參比指

4、示酶。研究發(fā)現(xiàn)，在MP脅迫下，海兔胸膜足神經(jīng)節(jié)各暴露組中SOD與CAT活性的變化趨勢與MP暴露時間、暴露濃度及不同器官組織有關(guān)，其酶活性變化波動較大。MP抑制AChE活性率與外加的MP濃度呈正相關(guān)。在相同的MP濃度下，脅迫時間為7天時，海兔胸膜足神經(jīng)節(jié)AChE活性抑制率高于14天。海兔神經(jīng)節(jié)內(nèi)SOD、CAT和AChE酶活性均適合用于監(jiān)控MP產(chǎn)生的污染程度和危害性，但選用AChE和SOD作為指示酶蛋白要比CAT更加有效、準(zhǔn)確和適用。

5、>　　 膜蛋白在執(zhí)行許多細(xì)胞生物功能中發(fā)揮著重要作用，它與許多疾病的形成有關(guān)，并是大多數(shù)藥物和毒物作用的靶點(diǎn)，因此，對膜蛋白的研究具有十分重要的意義。本論文采用膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)且兩個不同時間段，研究在不同濃度MP脅迫下，海兔左右胸膜足神經(jīng)節(jié)表達(dá)的差異膜蛋白，其中在7天暴露過程中，左右神經(jīng)節(jié)分別獲得19和20個差異蛋白斑點(diǎn)；而14天暴露過程中，左右神經(jīng)節(jié)均分別獲得14個差異蛋白斑點(diǎn)，并選用肽質(zhì)量指紋(PMF)圖譜技術(shù)逐一進(jìn)行鑒定，其中3

6、0個蛋白質(zhì)被鑒定為膜蛋白。選用蛋白質(zhì)組分析軟件，對這些差異蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測和亞細(xì)胞定位分析，并進(jìn)行功能分類，可分為代謝調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原平衡、催化、轉(zhuǎn)運(yùn)和免疫應(yīng)激等，其中代謝相關(guān)蛋白占到52％，其次信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白占24%。
　　 經(jīng)比對分析后，發(fā)現(xiàn)在參與代謝系統(tǒng)的蛋白中，因氧化脅迫的作用，使有氧代謝的酶類（如異檸檬酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、膜二肽酶等）的酶活性降低，以及蛋白、核酸代謝相關(guān)的焦磷酸酶的表達(dá)量減少，NADH脫氫

7、酶的酶活性升高，導(dǎo)致細(xì)胞能量和物質(zhì)合成的效率減低。而果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(ALD)，精氨酸激酶及ATP合成酶表達(dá)量的升高以及膜二肽酶表達(dá)量的降低，在一定程度上彌補(bǔ)了物質(zhì)能量的損失。此外，推測部分差異蛋白質(zhì)參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，主要有鳥嘌呤結(jié)合蛋白（G蛋白）、G蛋白偶聯(lián)受體、14-3-3蛋白、鈣調(diào)蛋白、膜聯(lián)蛋白等。參與細(xì)胞膜物質(zhì)運(yùn)輸?shù)牡鞍子校弘妷阂蕾囮庪x子通道、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子和ATP酶、載脂蛋白D等。與細(xì)胞免疫應(yīng)激有關(guān)的蛋白包括：T-細(xì)胞

8、受體、白細(xì)胞介素7受體、抑制素等。
　　 本文還選用Western blotting驗(yàn)證差異蛋白β-tubulin表達(dá)量下調(diào)趨勢以及膜蛋白組分的純度，即N-cadherin在膜組分和細(xì)胞質(zhì)組分中的含量，并選用RT-PCR方法驗(yàn)證了部分差異蛋白的變化規(guī)律。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步提高了對已篩選和鑒定的差異蛋白的可信度。本論文研究成果可為今后實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測流動水體中有機(jī)磷農(nóng)藥污染程度及危害性提供可行性分析技術(shù)，也為篩選高效蛋白指示物奠定良好