基于SWATH-MS技術(shù)的肝癌定量蛋白質(zhì)組學(xué)和激酶組學(xué)研究.pdf

1、肝癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤，在我國(guó)居癌癥死因第二位，具有生存期短、死亡率高等特征。肝癌診斷標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)仍是該研究領(lǐng)域亟待解決的難題。多個(gè)信號(hào)通路與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且各信號(hào)通路之間存在相互關(guān)聯(lián)，形成一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。對(duì)整個(gè)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)蛋白質(zhì)組和激酶組變化的研究有助于探索肝癌的發(fā)病機(jī)制，找到潛在的靈敏、特異性高的肝癌診斷標(biāo)志物和藥物靶標(biāo)。
　　在我國(guó)乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是引發(fā)肝

2、癌的最主要因素，本課題從定量蛋白質(zhì)組和激酶組視角切入，主要關(guān)注對(duì)HBV相關(guān)肝癌發(fā)生發(fā)展起重要作用的蛋白質(zhì)組和激酶組變化。采用SWATH-MS（按窗口順序采集所有理論質(zhì)譜譜圖，Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra）非標(biāo)記定量方法和多種小分子抑制劑親和富集激酶相結(jié)合的化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)，對(duì)臨床標(biāo)本（肝癌及癌旁組織）蛋白質(zhì)組和激酶組進(jìn)行全景式定量表征，遴選表達(dá)

3、量差異顯著的蛋白質(zhì)和激酶；進(jìn)一步運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行臨床樣本確證，為探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)潛在的肝癌診斷和藥物靶向標(biāo)志物提供研究線索。
　　SWATH-MS技術(shù)是目前一種先進(jìn)的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組技術(shù)，可規(guī)避傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組定量方法對(duì)于低豐度蛋白的定量偏差，具有樣品用量少、樣品前處理簡(jiǎn)單、蛋白鑒定覆蓋率高和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床樣本分析。本課題應(yīng)用SWATH-MS技術(shù)對(duì)肝癌和對(duì)應(yīng)癌旁組織的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了比較研究，共定量4,2

4、16種蛋白質(zhì)，其中338種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在肝癌和癌旁組織中有顯著差異，包括191種蛋白質(zhì)表達(dá)量在肝癌組織中增加，147種蛋白質(zhì)表達(dá)量在肝癌組織中減少。對(duì)差異蛋白質(zhì)的 KEGG通路分析提示，表達(dá)量在肝癌組織中顯著變化的蛋白質(zhì)參與了多種不同的信號(hào)通路。本文重點(diǎn)對(duì)參與代謝通路的差異蛋白質(zhì)進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，在肝癌組織中高表達(dá)蛋白質(zhì)主要涉及糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和脂肪酸生物合成途徑；在肝癌組織中低表達(dá)蛋白質(zhì)主要涉及糖異生途徑，絲氨酸、甘氨酸

5、和肌氨酸生物合成/代謝和脂肪酸-氧化途徑。這些代謝通路變化共涉及二十七種關(guān)鍵酶分子，包括PCK2、PDH和G6PD等。本研究定量的表達(dá)差異蛋白質(zhì)將為肝癌藥物靶標(biāo)或診斷性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供重要線索。
　　為定量研究肝癌組織樣品中激酶的表達(dá)變化，本文運(yùn)用化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)，將絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑Purvalanol B和受體酪氨酸激酶抑制劑SU6668與EAH Sepharose4B固相偶聯(lián)，或?qū)⒏咝V譜激酶抑制劑VI16832與 E

6、CH Sepharose4B固相偶聯(lián)，富集激酶，然后結(jié)合非標(biāo)記定量SWATH-MS技術(shù)，對(duì)肝癌組織與對(duì)應(yīng)癌旁組織的激酶進(jìn)行定量分析，共定量383種激酶，其中有93種激酶在肝癌和癌旁組織中表達(dá)量差異顯著，包括80種表達(dá)量在肝癌組織中增加的激酶和13種表達(dá)量在肝癌組織中減少的激酶。93種差異顯著激酶中有蛋白激酶73種，在人類激酶組9類激酶中均有分布。此外，本研究激酶組數(shù)據(jù)顯示，表達(dá)量在肝癌組織中顯著變化的激酶涉及了多條信號(hào)通路，主要包括MA

7、PK信號(hào)通路、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路和Hedgehog信號(hào)通路，VEGFR-2、CDK6和mTOR等參與了這些重要的信號(hào)通路。這些結(jié)果表明，多種小分子抑制劑親和富集激酶結(jié)合SWATH-MS非標(biāo)記定量的化學(xué)蛋白質(zhì)組技術(shù)，能夠有效的找到可能參與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵激酶。
　　此外，本課題對(duì)參與肝癌復(fù)雜信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵差異激酶及其小分子激酶抑制劑（Small-molecule kinase

8、inhibitors,SMKIs）進(jìn)行了文獻(xiàn)調(diào)研。除已經(jīng)被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration,FDA）批準(zhǔn)用于肝癌治療含VEGFR-2靶點(diǎn)的多靶點(diǎn)小分子激酶抑制劑sorafenib外，以VEGFR-2為靶點(diǎn)用于腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌治療的小分子激酶抑制劑 lenvatinib，以及其他含VEGFR-2靶點(diǎn)的用于其他癌癥治療的多靶點(diǎn)小分子激酶抑制劑如pazopanib、vandetanib、axi

9、tinib、regorafenib、cabozantinib、ponatinib和nintedanib均有可能成為潛在的肝癌治療藥物。同時(shí)，以CDK4和CDK6為作用靶點(diǎn)用于乳腺癌治療的小分子激酶抑制劑palbociclib和剛批準(zhǔn)的ribociclib，以及以mTOR為靶點(diǎn)用于腎細(xì)胞癌治療的小分子藥物sirolimus、temsirolimus和everolimus，也均可能成為潛在的肝癌治療藥物。因此，應(yīng)用小分子激酶抑制劑富集激酶和