主要禽病的實驗室檢測方法及結(jié)果分析

1、主要禽病的實驗室檢測方法及結(jié)果分析,張國中（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)）2011年4月23日,2,（一）血清學(xué)檢測方法 1、免疫血清學(xué)技術(shù)抗原與抗體在體內(nèi)（外）均可發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因為抗體主要來自于血清，在體外進行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)。,一、常用的實驗室檢測方法,,3,血清學(xué)反應(yīng)的一般特點高度特異性反應(yīng)可逆性反應(yīng)二階段性影響反應(yīng)的因素,4,血清學(xué)反應(yīng)的應(yīng)用抗原抗體的快速檢測微生物的鑒定與分析生

2、物活性物質(zhì)的超微定量抗原抗體在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平定位,,,5,2、血清學(xué)反應(yīng)類型及常用試驗方法,6,（1）平板凝集試驗（SPA）基本原理：細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆粒狀抗原與相應(yīng)抗血清在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的顆粒凝集現(xiàn)象。主要應(yīng)用：雞白痢（SP） 支原體（MG/MS）,圖1 平板凝集試驗檢測結(jié)果,8,（2）血凝（HA）和血凝抑制試驗（HI）基本原理：某些病毒（如NDV）能夠凝集特定種類動物

3、的紅細(xì)胞，此即紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。這種紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象可以被特異性抗血清所抑制，即紅細(xì)胞凝集抑制試驗。主要應(yīng)用：新城疫（ND） 禽流感（AI） 產(chǎn)蛋下降綜合癥（EDS） 雞傳染性支氣管炎（IB）,圖2 血凝抑制試驗檢測結(jié)果,G. Cattoli （OIE）,10,（3）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）基本原理

4、：可溶性抗原（毒素、病毒、細(xì)菌裂解液）與相應(yīng)抗體結(jié)合, 在電解質(zhì)存在情況下，產(chǎn)生可見的沉淀物。主要應(yīng)用：雞馬立克氏病病毒（MDV）

5、 雞痘病毒（FPV）,圖3 瓊脂擴散試驗檢測結(jié)果1. 抗原；2. 陽性對照；3-6. 待檢血清；7. 陰性對照,12,（4）病毒中和試驗（VN）基本原理：抗原與相應(yīng)的抗血清按適當(dāng)比例混合作用后，可被中和而失去感染實驗動物、組織細(xì)胞或雞胚的能力。主要應(yīng)用：雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）的血

6、清分型。,圖4 采用雞胚接種進行IBV分離,空白對照,病毒接種,,,圖5 采用中和試驗對疑似IBV分離物進行鑒定與分型,空白對照,病毒接種,病毒+抗血清,,,,15,（5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）基本原理：抗原抗體反應(yīng)的特異性 酶促反應(yīng)的高效性使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面并保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與某種酶連接成酶標(biāo)物，這種酶標(biāo)抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保

7、留酶的活性。,16,主要應(yīng)用：多種禽病檢測抗體檢測最常用ELISA方法：間接法，是利用酶標(biāo)記的抗抗體（一般為抗雞IgG）檢測已與固相抗原結(jié)合的抗體。,圖6 間接ELISA方法測抗體的基本原理示意圖,18,考慮血清學(xué)檢測的目的血清樣品的采集方法采集血清樣品的數(shù)量血清樣品的標(biāo)記血清樣品的貯藏及運輸,3、血清學(xué)檢測應(yīng)注意的問題,19,1、病原分離鑒定 （1）定義：指通過人工培養(yǎng)的方法分離出病原體的過程。,（二）病原學(xué)檢測方法,2

8、0,（2）病原分離主要目的進行疾病診斷疾病確診的黃金方法病原學(xué)研究的基礎(chǔ),21,（3）病原分離方法細(xì)菌分離培養(yǎng)：各種培養(yǎng)基病毒分離鑒定：雞胚、細(xì)胞或?qū)嶒瀯游锝臃N,22,（4）進行病毒分離應(yīng)注意的問題樣品采集時間采集樣品種類樣品貯藏及運輸常見接種途徑常用鑒定方法,23,2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（1）主要目的：通過對特異性基因片段的檢測達到檢測病原體的目的。（2）優(yōu)缺點：方便快捷、存在假陽（陰）性,圖7 常規(guī)RT

9、-PCR檢測結(jié)果（電泳圖）,25,3、其它病原學(xué)檢測方法（1）血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗（2）瓊脂免疫擴散試驗（AGP）（3）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（4）膠體金試紙條檢測（5）動物實驗檢查,26,1、雛雞母源抗體檢查（1-3日齡） （1）了解原產(chǎn)地的免疫種類了解原產(chǎn)地易發(fā)病種類及保護性水平確定需根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r加免的疫苗根據(jù)抗體反應(yīng)追蹤是否有過感染,二、實驗室監(jiān)測方案的制定,27,（2）了解母源抗體水平

10、根據(jù)母源抗體水平及各種疫病母源抗體半衰期合理確定疫苗首免時間了解雛雞免疫保護能力，便于疫病診斷,28,2、免疫檢查 （1）免疫前檢查目的是了解免前抗體水平、決定免疫時間和進行免疫效果評價。 初免前檢查 再免前檢查,29,（2）免疫后檢查目的是檢查免疫效果，評價免疫成功或失敗，盡快采取相應(yīng)措施確保生產(chǎn)安全。通常應(yīng)選擇免疫后14-21天進行。,30,（3）定期檢查目的是規(guī)律性檢查抗體消長水平以便及時采取補救措施，分析各種免疫

11、之間的相關(guān)性，調(diào)整免疫程序。,31,（4）重要節(jié)點檢查30~50d檢查（檢查前幾次免疫效果）開產(chǎn)前檢查（產(chǎn)蛋期及雛雞保護性抗體需求）36~40W檢查（確定抗體水平、適時補免）,32,3、生產(chǎn)發(fā)生變動時的檢查 （1）日常規(guī)律性抗體監(jiān)測做為發(fā)病時檢查的參考數(shù)據(jù)做為雞群抵抗力的依據(jù)，指示病因分析方向做為流行病學(xué)分析數(shù)據(jù)，利于發(fā)現(xiàn)病原變異,33,（2）雙份血清檢測鑒于發(fā)病后抗體常有明顯升高，雙份血清抗體值對比分析有很好的診斷價

12、值。,34,（3）抗原檢測某些情況下，抗原檢測可以直接證實感染狀況的存在。,35,（4）未免疫雞群抗體檢測未免疫雞群某疾病抗體的出現(xiàn)，特別注意雛雞母源抗體消失后抗體的再出現(xiàn)以及隨日齡增加而抗體持續(xù)上升的現(xiàn)象，這對疾病診斷十分重要。,36,4、重要疫病流行動態(tài)分析流行動態(tài)分析對生產(chǎn)企業(yè)來說，開展具有一定的難度，但對重要疫病，尤其是重點進行免疫防控的疫病仍然值得重視，對長期的流行資料進行分析，會得到極為有益的技術(shù)支持。,37,流行動態(tài)

13、分析需要進行大量工作，除抗體監(jiān)測外，必需配合針對性的實驗室研究工作，如病原分離鑒定、動物實驗和必要的分子生物學(xué)研究。,38,1、HI檢測結(jié)果與分析 （1）常見HI檢測結(jié)果,三、重要疫病的常見檢查結(jié)果與分析,圖8 種雞開產(chǎn)前NDV抗體檢測情況,40,（2）免疫抗體空檔期15-25d是母源抗體逐漸消失，新的免疫抗體尚未建立的時期野毒侵襲大多發(fā)生于此，一般18-25d多發(fā)空檔期隨免疫（程序和疫苗）成功達到最短,圖9 NDV母源抗體衰

14、減情況,圖10 15-30日齡雛雞NDV抗體檢測情況,43,（3）HI檢查的抗體離散度在4lg2內(nèi)是允許范圍大于4lg2的基本原因初免時母源抗體水平參差不齊免疫成功率不高-漏免太多疫苗質(zhì)量不好二免后離散度應(yīng)達到要求,44,（4）抗體保護臨界值通過攻毒試驗加以驗證的結(jié)果AIV要求≥26NDV要求≥28-10臨界值是針對有效保護對等而言，即疫苗和流行毒株有良好的相關(guān)性。當(dāng)流行毒株變異而疫苗株保護性不足時，原有臨界值在一

15、定程度上失去意義，需要新確立或提高臨界值水平。,45,（5）診斷試劑問題抗原問題：抗原不純（影響HA的確定）抗原制備毒株和流行毒株存在明顯差異陽性血清問題：陽性血清不純,46,（6）診斷指標(biāo)H5N1雙份血清檢測：應(yīng)用常規(guī) Re-4、Re-5苗免疫情況下，如果知道發(fā)病前抗體水平，則發(fā)病后10-14d可檢測出Re-4、Re-5抗體滴度上升22-3。未免相應(yīng)疫苗的情況下，檢測變異株抗體達到26-9有診斷價值。,圖11 某肉種雞群

16、發(fā)生H5感染前后抗體檢測結(jié)果（38W發(fā)生，2W產(chǎn)蛋率75%→5%，死淘20%）,圖12 某肉種雞群H5感染后變異株抗體檢測結(jié)果（換羽24W發(fā)生，降蛋10%，累計死亡率5%）,49,H9N2產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14天，HI抗體20%以上達到212以上有診斷價值。雛雞20-30d HI抗體達到26-9有診斷價值。,50,ND產(chǎn)蛋雞發(fā)病后10-14d，HI抗體≥213有診斷價值。雛雞20-35d HI抗體達到26-9有診斷價值。,圖

17、13 某肉種雞群發(fā)生NDV感染后抗體檢測結(jié)果,52,HI診斷應(yīng)注意的問題HI診斷應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)，當(dāng)臨床表現(xiàn)無異常而檢測結(jié)果異常時往往是檢測結(jié)果出了錯，應(yīng)提高警惕。,53,2、平板凝集試驗（SPA）檢測結(jié)果與分析 （1）可用于MG、MS、SP檢查 （2）可進行血清平板和全血平板，相對來說血清平板更準(zhǔn)確和易于判斷。,54,（3）SPA準(zhǔn)確率相對較差，假陽性率高，一般群體檢查超過30%以上陽性才有確實群體感染的診斷意義。（

18、4）國內(nèi)產(chǎn)品和國外產(chǎn)品特異性上有一定差距。,55,3、瓊脂擴散試驗（AGP）檢測結(jié)果與分析 （1）可用于MD、POX和IC （2）對MD可進行抗體、抗原兩種檢測50d左右，50%以上抗體陽性預(yù)示疫苗反應(yīng)正常用羽髓做瓊擴有發(fā)病診斷價值,56,（3）POX常不用檢測，通過觀察接種部位反應(yīng)可了解免疫效果，觀察臨床癥狀進行疫病診斷。（4）IC的瓊擴試劑很少，可從國外進口或選用日本北里所的間接血凝試劑。,57,4、ELISA

19、檢測結(jié)果與分析 （1）目前可應(yīng)用ELISA檢測的疾病ND、AI MG、MS、SPIB、IBD、REO、AE、 RE、ILT、CIAALV-A/B、ALV-J、ALV-Ag,58,（2）常見ELISA檢測結(jié)果,59,（3） ELISA試劑盒之間的差異每種試劑盒都有自己的特定的陽性值及敏感范圍。原則上同一疾病不同廠家ELISA試劑盒之間沒有直接可比性，除非做過平行對比研究。同一病原的抗體檢測可能針對的抗原表位不同會得到不同

20、結(jié)果，要格外慎重。,60,（4）對REV檢測結(jié)果的認(rèn)識REV抗體檢測結(jié)果應(yīng)該為陰性。20-30d檢出陽性率超過20％則預(yù)示雞群可能存在嚴(yán)重免疫抑制問題。,61,當(dāng)1-15d檢出100％陽性率時，可能大雞免疫或污染過；檢出少于5％陽性率時，可能種雞是污染群或假陽性結(jié)果。超過30d以上的檢測通常都只能做為污染的佐證，但至少20%以上才有生產(chǎn)影響意義。,圖14 某雞場免疫禽痘疫苗后的REV抗體檢測結(jié)果（2W免疫，8W和11W檢測）,圖

21、15 某雞痘重組疫苗污染REV的檢測情況,圖16 污染雞痘疫苗分離REV的遺傳進化關(guān)系,65,（5）ALV檢測利用種蛋進行ALV抗原檢測準(zhǔn)確度較好。肛拭子抗原檢測假陽性較高，高陽性率有一定意義?？贵w檢測在不同日齡意義不同，雛雞5%以下，開產(chǎn)前10%以下可能不會形成生產(chǎn)問題。目前ELISA試劑盒均不能區(qū)分內(nèi)外源病毒。,66,（6）有診斷價值的數(shù)據(jù)IB、Reo的ELISA抗體>15000預(yù)示存在野毒感染。應(yīng)達到的指標(biāo)在相應(yīng)

22、日齡檢測達不到，指示免疫失敗，應(yīng)追蹤疫苗質(zhì)量和免疫技術(shù)。長期檢測有助于了解抗體變化規(guī)律，用于指導(dǎo)疫苗選擇和免疫程序的制定。按照常規(guī)做檢測，有利于發(fā)病診斷和監(jiān)督生產(chǎn)問題的發(fā)現(xiàn)。,圖17 25W肉種雞群IBV的ELISA抗體檢測結(jié)果,圖18 抗體異常血清雞胚中和試驗檢測結(jié)果,空白對照,A2毒+A2血清,A2毒對照,A2毒+待檢血清,,,,,圖19 某1日齡雛雞群MS抗體檢測情況,圖20 某50日齡雞群MS抗體檢測情況,圖21 某35W肉