艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、艾滋病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),平羅縣婦幼保健所徐秀琴,HIV抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全,二個(gè)方面,二、 HIV抗體檢測(cè),《全國(guó)艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》 引用文件： 《艾滋病和艾滋病病毒感染診斷標(biāo)準(zhǔn)》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，WS293-2008）,常規(guī)HIV抗體檢測(cè)的方法,HIV抗體檢測(cè)分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）和確證試驗(yàn)。 篩查試劑 必須是經(jīng)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑，其中酶聯(lián)免疫試劑應(yīng)批批檢合格

2、。推薦使用臨床質(zhì)量評(píng)估敏感性和特異性高的試劑。,HIV抗體檢測(cè)要求,1. 實(shí)驗(yàn)室:經(jīng)衛(wèi)生行政部門考核、審評(píng)和批準(zhǔn)后2. 檢測(cè)場(chǎng)所：符合《全國(guó)艾滋病檢測(cè)工作規(guī)范》的要求；3. 人員: 經(jīng)國(guó)家或省級(jí)艾滋病抗體檢測(cè)學(xué)習(xí)班培訓(xùn);4. 試劑: 批批檢合格、進(jìn)口許可證、生物制品檢定所檢定、5. 保密: 初篩檢測(cè)的陽性結(jié)果不是最終結(jié)果,必須經(jīng)確證試驗(yàn)由 HIV抗體確證實(shí)驗(yàn)室出具陽性報(bào)告才具有法律效應(yīng),且須由衛(wèi)生行政部門選擇適當(dāng)方式和時(shí)

3、間通知其本人及其家屬,不得向無關(guān)人員透露有關(guān)情況,感染者檔案以機(jī)密形式專人負(fù)責(zé)管理;6. 標(biāo)本: 及時(shí)分離血清(漿)、無變質(zhì)、無污染、無溶血。7. 天氣炎熱、路途較遠(yuǎn)時(shí)應(yīng)低溫用帶蓋不易破損容器專人運(yùn)送， 并詳細(xì)填寫送檢單；城區(qū)24小時(shí)、農(nóng)村48小時(shí)內(nèi)送確證實(shí)驗(yàn)室,篩查樣品和方法,樣品：可采用血清、血漿、濾紙干血斑、唾液和尿液樣品。 （人類免疫缺陷病毒抗體口腔黏膜滲出液診斷試劑 ）

4、方法 1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 2.化學(xué)發(fā)光或免疫熒光試驗(yàn) 3.快速檢測(cè)（RT）及其它檢測(cè)試驗(yàn) 這類試驗(yàn)簡(jiǎn)便快速，適用于應(yīng)急檢測(cè)、門診急診檢測(cè)。一般可在10～30分鐘內(nèi)得出結(jié)果。 明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA） 免疫滲濾試驗(yàn) 免疫層析試驗(yàn),

5、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)簡(jiǎn)稱酶標(biāo)法，是根據(jù)酶免疫測(cè)定原理發(fā)展的一種技術(shù)，目前已廣泛用于各種抗原和抗體的檢測(cè)，也是最常用的HIV抗體檢測(cè)方法。 目前已推出第四代HIV抗體ELISA檢測(cè)試劑，但其基本方法分三類：間接法、雙抗原夾心法和抗原競(jìng)爭(zhēng)法。,快速試劑的應(yīng)用,偏遠(yuǎn)地區(qū)急診臨床（高危）職業(yè)暴露臨產(chǎn),HIV快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),試劑穩(wěn)定，室溫長(zhǎng)期存放不需要大型設(shè)備操作簡(jiǎn)便、迅速、肉眼可讀特異性、功效率基本與ELISA接

6、近適用于應(yīng)急檢測(cè)和個(gè)體檢測(cè),HIV快速的局限性,一般不用于血液篩查有一定的假陽性反應(yīng)窗口期問題（假陰性）（小于3個(gè)月）主觀因素,HIV快速檢測(cè)的注意事項(xiàng),有關(guān)部門批準(zhǔn)有效的試劑從事人員經(jīng)過培訓(xùn)，上崗證嚴(yán)格按試劑說明書操作有效期使用，正確儲(chǔ)存18-25℃實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下操作嚴(yán)格按照試劑說明書的時(shí)間要求進(jìn)行判讀結(jié)果，不可早判或晚判建立室內(nèi)（間）質(zhì)控體系，定期用質(zhì)控血清對(duì)試劑進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否顯色，顯色時(shí)間，顯色程度。,HI

7、V快速檢測(cè)的注意事項(xiàng),條帶的色深程度與標(biāo)本中抗體的濃度不存在線性關(guān)系陰性結(jié)果不排除有HIV感染的可能出現(xiàn)陽性及可疑結(jié)果，還應(yīng)用ELISA法及時(shí)復(fù)檢并確證判讀結(jié)果雙人核對(duì)判讀結(jié)果的環(huán)境需要光線充足,篩查程序,（1）初篩試驗(yàn) 根據(jù)檢測(cè)目的選用符合要求的篩查試劑對(duì)樣品進(jìn)行初篩檢測(cè)，對(duì)呈陰性反應(yīng)的樣品，可出具HIV抗體陰性（-）報(bào)告；對(duì)呈陽性反應(yīng)的樣品，需要進(jìn)一步做復(fù)檢試驗(yàn)和確證試驗(yàn)。（2）復(fù)檢試驗(yàn) 對(duì)初篩呈陽性

8、反應(yīng)的樣品，應(yīng)使用原有試劑和另外一種不同原理（或廠家）的試劑，或另外兩種不同原理或不同廠家的試劑進(jìn)行復(fù)檢試驗(yàn)。如果初篩檢測(cè)使用抗原抗體聯(lián)合試劑，則復(fù)檢必須包括一種抗原抗體聯(lián)合試劑。如兩種試劑復(fù)檢均呈陰性反應(yīng)，則報(bào)告HIV抗體陰性（-）；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確證實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確證試驗(yàn)（圖1）。如果抗原抗體聯(lián)合試劑檢測(cè)呈陽性反應(yīng)，而抗體試劑檢測(cè)為陰性反應(yīng)，則應(yīng)考慮進(jìn)行HIV-1 p24抗原或核酸檢測(cè)，必要時(shí)進(jìn)行隨訪。艾滋病檢

9、測(cè)篩查實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢判定為陽性反應(yīng)的樣品，確證實(shí)驗(yàn)室可以直接進(jìn)行確證試驗(yàn)。,,HIV,HIV抗體初篩檢測(cè)的局限性,1. 陽性反應(yīng)樣本不能確證，需用本法和其它方法復(fù)檢，如仍為陽性，需確證試劑進(jìn)一步確證。2. 陰性結(jié)果不能排除HIV感染：HIV感染后血清陽轉(zhuǎn)前的“窗口期”，HIV抗體檢測(cè)為陰性，晚期艾滋病患者某些抗體（如P24等）可能檢測(cè)不到。3. 可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果：了解試劑供應(yīng)商因其使用抗原和包被方法技術(shù)存在一定差異。4.不能

10、診斷<18月齡新生兒的母嬰垂直感染。,篩查試驗(yàn)結(jié)果的報(bào)告,篩查試驗(yàn)（-） 出具“HIV抗體陰性”報(bào)告 篩查試驗(yàn)（+） 出具“HIV抗體待復(fù)查”，不能出陽性報(bào)告 篩查試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)送 如需送上級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行復(fù)檢，需要核對(duì)身份，補(bǔ)充個(gè)人信息（如姓名和身份證號(hào)碼），必要時(shí)采集第二份血樣，持HIV抗體篩查報(bào)告，送當(dāng)?shù)匕滩『Y查中心實(shí)驗(yàn)室，或直接送確證實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢。 兩次檢測(cè)均陽性或一陰一陽報(bào)告為 “HIV抗體待確證

11、”； 兩次檢測(cè)均陰性報(bào)告為“HIV抗體陰性（-）”。 HIV抗體復(fù)檢報(bào)告需由1名檢驗(yàn)人員和1名審核人員簽字。,初篩檢測(cè)中值得注意的幾個(gè)問題(1),1、初篩檢測(cè)的陽性結(jié)果不是最終結(jié)論，不能通知受檢者及其他人員，陽性樣本需用該試劑和另一種試劑復(fù)檢，如仍為陽性，應(yīng)及時(shí)送HIV抗體確證試驗(yàn)室用確證試驗(yàn)檢測(cè)；2、初篩檢測(cè)的宗旨是要盡可能檢出所有的陽性樣本，因此應(yīng)選用敏感性高的試劑，且必須為HIV-1/2混合型，使用不符合規(guī)定的試劑可

12、能導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果和法律糾紛，甚至造成嚴(yán)重后果；3、各單位可根據(jù)不同目的、檢測(cè)對(duì)象、人群流行率、成本-效 益比、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備、和技術(shù)水平等選擇不同初篩實(shí)驗(yàn)方法。,初篩檢測(cè)中值得注意的幾個(gè)問題(2),4、不同廠家及同一廠家生產(chǎn)的不同批次試劑的敏感性和特異性可能存在一定差異，各實(shí)驗(yàn)室最好應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控血清對(duì)新購(gòu)試劑及在每次檢測(cè)時(shí)進(jìn)行質(zhì)量控制和質(zhì)量評(píng)價(jià)，以確保檢測(cè)工作結(jié)果的準(zhǔn)確可靠性；5、針對(duì)HIV感染的不同時(shí)期選用不同的檢測(cè)方法：6、H

13、IV抗體的檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度與HIV感染的概率： 許多HIV抗體檢測(cè)方法既是一種定性實(shí)驗(yàn)，也是一種半定量實(shí)驗(yàn)。ELISA方法可根據(jù)OD值的強(qiáng)度確定抗體量的多少。反應(yīng)性越強(qiáng)的血清，含有HIV抗體的可能性越大。,濾紙干血斑標(biāo)本（dry blood spot （DBS）on filter paper）,是將采集的新生兒血樣滴在篩查專用濾紙上而制成的圓形均勻斑狀血樣一般專用于新生兒疾病篩查實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。濾紙片是血液標(biāo)本采集和運(yùn)輸?shù)臉O好載體，

14、應(yīng)用全血滴在濾紙片上制成濾紙片干血斑，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，且有很好的生物穩(wěn)定性，因此，特別適用于發(fā)展中國(guó)家邊遠(yuǎn)地區(qū)的樣本采集、貯存與運(yùn)輸。,濾紙干血斑標(biāo)本 （DBS）的采集,采血對(duì)象和采血時(shí)機(jī)(新生兒生后3天（或48~72小時(shí)）進(jìn)行 )材料和器具采血方法和技巧DBS血斑質(zhì)量標(biāo)本收集方法標(biāo)本保存方法,材料和用具,載血濾紙：S&S903的專用濾紙 采血卡,其他材料,信息卡 穿刺針 采血卡支架 75%酒精和消毒干棉球熱

15、水袋或熱敷用毛巾,采血方法,符合美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）標(biāo)準(zhǔn)《新生兒篩查計(jì)劃》中濾紙血片的采集方法,采血前準(zhǔn)備,登記，查對(duì)，填卡，洗手，戴口罩 采血部位清潔，保暖，血循環(huán)良好（可用40-42℃熱敷）,采血部位選擇,足跟兩側(cè)涂黑處允許采血,穿刺和擠壓,一次性使用穿刺針。進(jìn)針2~3毫米。拭去最初少許血滴（含碎片）待穿刺點(diǎn)的蒼白區(qū)消褪后，用母、食指和手掌握持足部，適當(dāng)施壓。,取血,血液順利流出，等血滴夠大時(shí)，用載血

16、濾紙的一面輕觸血滴，使血樣吸進(jìn)濾紙透過背面一次形成直徑約1厘米的血斑共取3個(gè)血斑壓迫止血,,等血滴足夠大時(shí)用濾紙輕觸血滴,取數(shù)個(gè)直徑1cm血斑,晾干,室溫水平放置晾干2-3小時(shí)避免熱烤、日曬、紫外線照射、福爾馬林或其他有機(jī)溶劑熏染、液體污染等,濾紙干血斑標(biāo)本的送檢,原則：盡快送往→最佳：于標(biāo)本采集后24小時(shí)內(nèi)送出規(guī)范要求：采集后1周內(nèi)送達(dá),方法,①掛號(hào)信郵寄②人工投送③專收專投系統(tǒng)（綠色通道 ）是目前最先進(jìn)的遞送

17、技術(shù),HIV檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全,生物安全貫穿實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)的始終,實(shí)驗(yàn)室要求樣品的采集、運(yùn)送、接收、使用、保存、處理檢測(cè)操作中的生物安全儀器設(shè)備廢棄物處置意外事故的處理   實(shí)驗(yàn)室生物安全管理,個(gè)人防護(hù),1.手部皮膚有開放性傷口及其他不適于工作的情況，應(yīng)暫停工作。2.皮膚的微小傷口、擦傷、皸裂等，應(yīng)用防水敷料嚴(yán)密覆蓋。3.充足的防護(hù)服、一次性乳膠手套、口罩、帽子和覆蓋足背的工作鞋。應(yīng)將清潔的防護(hù)

18、服和其他個(gè)人防護(hù)用品置于實(shí)驗(yàn)室清潔區(qū)內(nèi)的專用處存放。4.應(yīng)急沖洗眼睛裝置。（30米）5.工作人員上崗前必須進(jìn)行HIV抗體和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等肝炎病毒標(biāo)志物檢測(cè)，應(yīng)接種乙肝疫苗。應(yīng)每年對(duì)工作人員采血檢測(cè)HIV抗體，血清應(yīng)長(zhǎng)期保留。6 進(jìn)實(shí)驗(yàn)室工作前要摘除首飾，修剪長(zhǎng)的帶刺的指甲，以免刺破手套。7 嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)食、飲水、吸煙和化妝。,個(gè)人防護(hù),8 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)穿合適防護(hù)服（白大衣、隔離衣或一次性工作服）、戴手套和

19、口罩、穿實(shí)驗(yàn)室專用的工作鞋。如接觸物的傳染性大、應(yīng)戴雙層手套；含有HIV的液體（樣品或病毒培養(yǎng)液）有可能噴濺時(shí)，應(yīng)戴防護(hù)眼鏡、穿防水（如塑料）圍裙。工作完畢，先脫去手套，再脫去防護(hù)服，用肥皂和流動(dòng)水洗手。穿過的污染的防護(hù)服應(yīng)及時(shí)放入污物袋中，消毒后方可洗滌或廢棄。 操作過程中，如發(fā)現(xiàn)防護(hù)服被污染應(yīng)立即更換，如手套破損，應(yīng)立即丟棄、洗手并換上新手套。不能用戴手套的手觸摸暴露的皮膚、口唇、眼睛、耳朵和頭發(fā)等。不要將手套清洗或消毒后

20、再次使用，因?yàn)槭褂帽砻婊钚詣┣逑纯墒故痔讓?duì)水的通透性增加，消毒劑可以引起手套的破損。9 禁止使用口腔吸液管，必須使用移液器來操作實(shí)驗(yàn)的所有液體。,意外事故處理,1.皮膚針刺傷或切割傷，應(yīng)立即用肥皂和大量流水沖洗，盡可能擠出損傷處的血液，用70%乙醇或其它消毒劑消毒傷口。2 皮膚污染：用水和肥皂沖洗污染部位，并用適當(dāng)?shù)南緞┙荩?0%乙醇或其它皮膚消毒劑。3 粘膜污染：用大量流水或生理鹽水沖洗污染部位。4 衣物污染：盡