實(shí)驗(yàn)6血清甘油三酯與膽固醇的測(cè)定2015

1、實(shí)驗(yàn)六 血清甘油三酯與膽固醇的測(cè)定,酶法測(cè)定血清中的甘油三酯,一. 目的要求,了解血清甘油三酯酶法測(cè)定的原理了解血清甘油三酯測(cè)定的臨床意義掌握酶標(biāo)儀測(cè)定法的原理和操作,二．實(shí)驗(yàn)原理,血清甘油三酯的測(cè)定是血脂分析的重要內(nèi)容之一。目前，國(guó)內(nèi)多數(shù)醫(yī)院采用酶法測(cè)定。酶法又分為：一步終點(diǎn)比色法和兩步終點(diǎn)比色法。兩步法的主要優(yōu)點(diǎn)是消除了游離甘油的干擾。脂蛋白脂肪酶（LPL）可將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。甘油在甘油激酶催化下，生成磷酸甘油，后

2、者在磷酸甘油氧化酶（GPO）催化下，生成磷酸二羥丙酮和H2O2。 H2O2在過(guò)氧化物酶（POD）催化下與4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反應(yīng)生成紫色醌亞胺染料。形成的醌亞胺染料色澤強(qiáng)度與樣品中甘油三酯的含量成正比。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測(cè)血清樣品反應(yīng)生成的醌亞胺染料吸光度（A）值，即可求出待測(cè)血清樣品中甘油三酯的濃量。,二．實(shí)驗(yàn)原理,反應(yīng)如下：,甘油三酯（TG）＋3H2O,甘油＋AT

3、P,甘油-1-磷酸＋O2,H2O2＋ 4-AAP ＋ ESPAS,目前，TG測(cè)定試劑盒多根據(jù)以上原理配制，用一步終點(diǎn)法測(cè)定。,甘油＋3RCOOH（脂肪酸）,甘油-1-磷酸＋ADP,磷酸二羥丙酮＋H2O2,醌亞胺 染料＋ 4H2O,三．器材及試劑,1．器材： 酶標(biāo)儀，酶標(biāo)板，37度恒溫箱，移液槍。2. 試劑：一步法：Tris-HCl緩沖液（pH7.6，濃度為150mmlo/L），LPL或脂肪酶（3000u/L），甘油激酶（

4、GK）（250u/L），ATP（0.5mmol/L），磷酸甘油氧化酶（GPO）（3000u/L），過(guò)氧化物酶（POD；辣根）（1000u/L），膽酸鈉（3.5mmol/L），硫酸鎂（17.5mmol/L），4-氨基安替比林（4-AAP）（1mmol/L），4-氯酚（3.5mmol/L），Triton X-100（0.1g/L）。,四．操作步驟,取酶標(biāo)條1個(gè)（每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)），按下表操作：,37℃保溫5min，空白調(diào)零，550nm處測(cè)定

5、各孔A值。,五．計(jì)算,（標(biāo)準(zhǔn)液濃度=2.26mmol/L）,（mmol/L）,正常參考值：0.56~~1.7mmol/L，老年約為：2.26mmol/L。美國(guó)國(guó)家膽固醇教育計(jì)劃對(duì)空腹TG水平分解線的修訂意見(jiàn)為（1993年）：TG正常：4.5mmol/L胰腺炎高危：>11.3mmol/L,六．注意事項(xiàng),試劑出現(xiàn)紅色不能再用，試劑空白吸光度A550nm<0.05；兩步法37℃ 4分鐘能完全排除游離甘油；GPO純度不高時(shí)

6、，因其它氧化酶的存在而產(chǎn)生額外的H2O2，使得結(jié)果偏高；溫度控制、吸量的準(zhǔn)確度對(duì)結(jié)果影響較大；甘油三酯增高常見(jiàn)于肥胖、糖尿病、腎病綜合癥、糖原沉積癥、高血壓、冠心病等，也隨年齡而上升。降低多見(jiàn)于甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能低下、肝功能?chē)?yán)重低下。,七．臨床意義,血脂是血漿所含脂類的統(tǒng)稱,血漿所含脂類統(tǒng)稱血脂，包括：甘油三酯、磷脂、膽固醇及其酯以及游離脂酸。,外源性——從食物中攝取 內(nèi)源性——肝、脂肪細(xì)胞及其他組織合成后釋放入血,定

7、義：,來(lái)源：,血脂含量受膳食、年齡、性別、職業(yè)及代謝等的影響，波動(dòng)范圍很大。,七．臨床意義,十二指腸下段及空腸上段。,飲食脂肪在小腸被吸收,吸收部位：,吸收方式：,七．臨床意義,消化吸收和內(nèi)源性合成的脂酸，以游離的形式存在較少，大多數(shù)以酯化的形式存在于甘油三酯之中而存在于體內(nèi)。,（二）甘油三酯的主要作用是為機(jī)體提供能量,（一）甘油三酯是脂酸的主要儲(chǔ)存形式,1. 甘油三酯是機(jī)體重要的能量來(lái)源,2. 甘油三酯是機(jī)體的主要能量?jī)?chǔ)存形式,男性：

8、21%，女性：26％,1g TG = 38kJ,七．臨床意義,（三）甘油三酯是3分子長(zhǎng)鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。甘油三酯是人體內(nèi)含量最多的脂類，大部分組織均可以利用甘油三酯分解產(chǎn)物供給能量。甘油三酯大部分是從飲食中獲得的，同時(shí)肝臟、脂肪等組織還可以進(jìn)行甘油三酯的合成，在脂肪組織中貯存。（四）甘油三酯增高常見(jiàn)于肥胖、糖尿病、腎病綜合癥、糖原沉積癥、高血壓、冠心病等，也隨年齡而上升。降低多見(jiàn)于甲狀腺功能亢進(jìn)、腎上腺皮質(zhì)功能低下、肝功能

9、嚴(yán)重低下。,八．思考題,簡(jiǎn)述酶法測(cè)定甘油三酯的原理。正常人空腹血清TG濃度是多少？說(shuō)明TG的測(cè)定的臨床意義。,酶法測(cè)定血清中的膽固醇,一. 目的要求,了解血清膽固醇氧化酶法測(cè)定的原理了解血清膽固醇測(cè)定的臨床意義鞏固酶標(biāo)儀測(cè)定法的原理和操作,二．實(shí)驗(yàn)原理,膽固醇脂酶可將膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸。膽固醇在膽固醇氧化酶催化下，生成膽甾烯酮和H2O2。H2O2在過(guò)氧化物酶（POD）催化下與4-氨基安替比林（4-AAP）及ESPAS（3

10、-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺）反應(yīng)生成紫色醌亞胺染料。形成的醌亞胺染料色澤強(qiáng)度與樣品中膽固醇的含量成正比。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和待測(cè)血清樣品反應(yīng)生成的醌亞胺染料吸光度（A）值，即可求出待測(cè)血清樣品中總膽固醇的濃量。反應(yīng)如下：,膽固醇酯（TC）＋H2O,H2O2＋ 4-AAP ＋ ESPAS,醌亞胺 染料＋ H2O,膽固醇+RCOOH,膽固醇+O2,,,,膽固醇脂酶,膽固醇氧化酶,過(guò)氧化物酶,三．器材及試劑,1．器材：（1）酶標(biāo)

11、儀（2）恒溫水浴箱,三．器材及試劑,2．試劑：,四．操作步驟,取酶標(biāo)條1個(gè)（每個(gè)樣品2個(gè)重復(fù)），按下表操作： 37℃保溫5min，空白調(diào)零，550nm處測(cè)定各孔A值。,五．計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)液濃度=5.17mmol/L,（mmol/L）,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,膽固醇為固醇類中的重要物質(zhì)，是環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。,膽固醇酯化的位點(diǎn),,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,1．膽固醇的生理功能是生物膜的重要成分，對(duì)控制生物膜的流動(dòng)性有

12、重要作用；是合成膽汁酸、類固醇激素及維生素D等生理活性物質(zhì)的前體。,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,2．膽固醇在體內(nèi)含量及分布 含量： 約140克 分布：廣泛分布于全身各組織中大約1/4分布在腦、神經(jīng)組織肝、腎、腸等內(nèi)臟、皮膚、脂肪組織中也較多肌肉組織含量較低腎上腺、卵巢等合成類固醇激素的腺體含量較高 存在形式： 游離膽固醇 30% 膽固醇酯 70%,六．

13、相關(guān)知識(shí)與臨床意義,3．膽固醇的合成部位 ⑴ 組織定位： 除成年動(dòng)物腦組織及成熟紅細(xì)胞外， 幾乎全身各組織均可合成， （肝最旺盛 ，其次為小腸） ⑵ 細(xì)胞定位： 胞液、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,4．膽固醇的合成步驟 一般認(rèn)為乙酸等物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)是合成膽固醇的原料。,限速酶：HMGCoA還原酶,合成前體——乙酸需要N

14、ADPH和ATP高度調(diào)控發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞液,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,5．膽固醇合成的調(diào)節(jié)限速酶HMG-CoA還原酶 ①酶的活性具有晝夜節(jié)律性 (午夜最高，中午最低 ） ②可被磷酸化而失活，脫磷酸可恢復(fù)活性 ③受膽固醇的反饋抑制作用 ④胰島素甲狀腺素能誘導(dǎo)肝HMG-CoA還原酶的合成，又促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼峥墒寡心懝檀枷陆?,,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,6．膽固醇的降解

15、 目前一般認(rèn)為膽固醇主要經(jīng)由膽汁排出體外。 由于環(huán)結(jié)構(gòu)不能代謝，體內(nèi)膽固醇的清除是將其轉(zhuǎn)變成膽汁酸，在分泌到小腸以后，部分隨糞便排出。,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,7．膽固醇的轉(zhuǎn)變,類固醇激素（ 腎上腺皮質(zhì)激素、孕激素、 雄激素、雌激素等）,,膽固醇,膽汁酸,７－脫氫膽固醇　　　　　維生素D,,,,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,8．血清膽固醇測(cè)定的臨床意義(1) 血清膽固醇濃度可作為酯類代謝的標(biāo)志，對(duì)糖尿

16、病患者的預(yù)后有重要意義。糖尿病昏迷患者幾乎都伴有血清膽固醇濃度的增加。膽固醇增加還見(jiàn)于動(dòng)脈粥樣硬化、腎病綜合征、總膽管阻塞及粘液性水腫。其他如肥大性骨關(guān)節(jié)炎、老年性白內(nèi)障、牛皮癬等，血清膽固醇濃度間或也有增加。（2）在惡性貧血、溶血性貧血以及甲狀腺功能亢進(jìn)時(shí)，血清膽固醇含量降低，其他如感染、營(yíng)養(yǎng)不良等情況下，膽固醇總量常見(jiàn)減低。（3）膽固醇酯系由膽固醇與脂肪酸結(jié)合而成，此反應(yīng)主要在肝臟內(nèi)進(jìn)行。肝臟有實(shí)質(zhì)性病變時(shí)，膽固醇的含量可顯著地

17、減少，同時(shí)在膽固醇總量?jī)?nèi)所占的比例亦明顯減低，故其測(cè)定有助于肝臟疾病診斷。膽固醇酯的含量與比例日漸減低是預(yù)后不良的征兆。,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,9．參考值 血清膽固醇水平與性別、年齡、飲食、生活習(xí)慣、精神因素、工作性質(zhì)、運(yùn)動(dòng)及吸煙等有關(guān)。 成人參考值為：2.8－6.0mmol/L（100－230mg/dl） 血清正常上限值：< 5.20mmol/L 危險(xiǎn)閾值：5.20-6.20mmo

18、l/L 高膽固醇血癥：≥6.20mmol/L,六．相關(guān)知識(shí)與臨床意義,膽固醇增高、降低的常見(jiàn)疾病,膽固醇增高 膽固醇降低 家族性高膽固醇血癥 無(wú)β脂蛋白血癥 LDL-R缺陷 低β脂蛋白血癥 混合性高脂蛋白血癥 α脂蛋白缺乏癥 家族性高HDL血癥

19、 家族性LCAT缺乏癥 家族性Ⅲ型高脂蛋白血癥 內(nèi)分泌疾病 嚴(yán)重肝臟疾病 甲狀腺功能減低 急性肝壞死 糖尿?。ɑ杳裕?肝硬化 肝臟疾病 甲狀腺功能亢進(jìn) 阻塞性黃疸 艾迪生病