腹瀉病毒聯(lián)合檢測意義

1、腹瀉病毒聯(lián)合檢測的臨床意義,腹瀉病概述和腹瀉病毒檢測意義熒光免疫法及優(yōu)勢,Part1 腹瀉病概述和腹瀉病毒檢測意義,腹瀉病概述腹瀉病發(fā)病趨勢病毒等其他感染性腹瀉現(xiàn)狀病毒性腹瀉診斷臨床意義,腹瀉病概述,腹瀉病為多種病原、多種因素引起的以大便次數(shù)增多和大便性狀改變?yōu)樘攸c的一組疾病，是兒童患病和死亡的主要原因，也是營養(yǎng)不良的重要原因[1]。 我國每年有8.36億人次患腹瀉，其中5歲以下小兒占3億次。2005年中國小兒因急性腹

2、瀉死亡人數(shù)為160萬[1]。,[1]《兒童腹瀉病診治專家共識》中華醫(yī)學會兒科分會消化學組、中華醫(yī)學會兒科分會感染學組、中華兒科雜志通訊作者：陳潔浙江大學醫(yī)學院兒童醫(yī)院（杭州310003）,腹瀉病發(fā)病趨勢,[2]全國法定傳染?。ǜ篂a類）發(fā)病數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)來源：衛(wèi)計委網(wǎng)站）,病毒等其他感染性腹瀉現(xiàn)狀,病毒等其他感染性腹瀉現(xiàn)狀,2006年中國共報告其他感染性腹瀉病例741809例，報告發(fā)病率為56.73/0萬。既往調查農(nóng)村地區(qū)人群腹瀉發(fā)病率為

3、1220/10萬-3360/10萬，就診率為6.3%-50%，日本，2005年3046家兒科定點監(jiān)測的感染性腹瀉病例就達941572例，分析：中國其他感染性腹瀉的報告病例數(shù)與實際發(fā)病水平相差甚大[4]。,[4]《中國感染性腹瀉監(jiān)測策略的思考與建議 》作者單位： 中國疾病預防控制中心疾控處應急辦腸道傳染病防制辦 公室 ，作者： 張靜， 副研究員， 主要從事傳 染病監(jiān)測與控制工作,病毒等其他感染性腹瀉現(xiàn)狀,結果2011年共報告其他感染性

4、腹瀉患者836591例，發(fā)病率為62.39/10萬。病例發(fā)病年齡主要集中在0-5歲組，發(fā)病率為447.06／10萬（436098例），占總數(shù)的52.3％（436098／836591），報告病例發(fā)病有2個高峰，夏季（第23-35周），占34.33％（287231/836591）；冬季（第43-52周），占23.54％（196939／836591）。 報告的30起疫情中，5起有明確病原學診斷結果，其中，4起為諾如病毒引起。2011年

5、其他感染性腹瀉確診病例占報告病例數(shù)的7．16％（59929／836591），其中，病毒感染56687例，細菌感染3242例,[5]《2011年中國其他感染性腹瀉監(jiān)測現(xiàn)狀分析》《中華預防醫(yī)學雜志》 CAS CSCD 2013年第4期 328-332頁,共5頁,病毒性腹瀉診斷臨床意義,目前最常見的腹瀉病毒有4種，其中以輪狀病毒、腸道腺病毒最為常見。病毒性腹瀉中40%-60%由輪狀病毒感染引起，其次是腸道腺病毒、諾如病毒、星狀病毒感染[6]。

6、,[6]《病毒性腹瀉的研究進展》雷炳鈞，華西醫(yī)科大學 ；《臨床內(nèi)科雜志》1998年第4期；,病毒性腹瀉診斷臨床意義,腹瀉病臨床癥狀相仿，病毒性腹瀉的治療方案與細菌等引起的腹瀉有很大不同。有報道發(fā)現(xiàn)雙重病毒或多重病毒感染的腹瀉，其癥狀更嚴重，病情進展快，導致的死亡率更高。 由于腸道傳染病的臨床表現(xiàn)和常用的輔助檢查缺乏明顯的特異性，因此存在著疾病早期病原體診斷不明確的危險因素，從而存在著疾病早期濫用抗生素、生病期延長而增加患者痛苦和

7、經(jīng)濟負擔的客觀因素。 因此，針對輪狀病毒、腸道腺病毒研制快速準確的診斷技術，對指導臨床對癥治療和避免濫用抗生素有重要意義，特別是對嬰幼兒腹瀉診斷上更有意義。,[6]《病毒性腹瀉的研究進展》雷炳鈞，華西醫(yī)科大學 ；《臨床內(nèi)科雜志》1998年第4期；,病毒性腹瀉診斷臨床意義,1、為疾病診斷和鑒別診斷、臨床療效觀察和預后提供依據(jù)符合循證醫(yī)學原則，提升醫(yī)療診治科學性。癥狀學診治轉變?yōu)椴∫驅W診治客觀上降低抗生素濫用、縮短不必要的病程

8、減少不必要的病患痛苦、降低不必要的經(jīng)濟負擔不同的病因，不同的自然病史，不同的臨床相，不同的預后轉歸判斷,病毒性腹瀉診斷臨床意義,輪狀病毒最常見的致腹瀉病毒，常溫穩(wěn)定，在環(huán)境表面存活數(shù)日，糞便中可存活數(shù)月，55攝氏度30分鐘滅活糞口途徑傳染，秋冬季高發(fā)，起病急，潛伏期1~2天，癥狀期3~8天，發(fā)熱嘔吐腹痛，噴射性水樣腹瀉，易導致脫水病程自限，多數(shù)預后良好，嬰幼兒較重，少數(shù)脫水死亡首次感染可減少再次感染幾率，并減輕再次感染的

9、嚴重性，各型無交叉免疫，可多次感染,病毒性腹瀉診斷臨床意義,輪狀病毒輪狀病毒（Rotavirus，簡稱RV）是一種雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科。它是嬰兒與幼兒腹瀉的單一主因，幾乎世界上每個大約五歲的小孩都曾感染過輪狀病毒至少一次。然而，每一次感染后人體免疫力會逐漸增強，后續(xù)感染的影響就會減輕，因而成人就很少受到其影響。輪狀病毒總共有七個種，以英文字母編號為A、B、C、D、E、F與G。其中，A種是最為常見的一種，而人類輪狀病毒感染

10、超過90%的案例也都是該種造成的。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,輪狀病毒輪狀病毒是借由糞口途徑傳染的。它會感染與小腸連結的腸黏膜細胞（enterocyte）并且產(chǎn)生腸毒素（enterotoxin），腸毒素會引起腸胃炎，導致嚴重的腹瀉，有時候甚至會因為脫水而導致死亡。雖然輪狀病毒于1973年就被由澳洲的露絲·畢夏普（Ruth Bishop）所發(fā)現(xiàn)，而且造成嬰兒與幼兒總計超過50%以上因為嚴重腹瀉而住院治療的案例，但是在公共衛(wèi)生社群

11、中它仍然沒有被廣泛地重視，特別是在發(fā)展中國家更是如此。除了對人類健康的影響之外，輪狀病毒也會感染動物，是家畜的病原體之一。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,腸道腺病毒對溫度敏感，對含氯劑和脂溶劑不敏感，抗紫外線，認真洗手糞口途徑傳染終年可發(fā)病，冬春多發(fā)，病程長，多超過一周，腹瀉嘔吐，可多器官受累，心肌炎，CNS自限，預后良好，腺病毒是腸套疊的重要原因，40%的腸套疊與腺病毒有關感染后可獲得持久免疫力，很少二次感染,病毒性腹瀉診斷臨

12、床意義,腸道腺病毒腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70～90 nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構成。每個殼粒的直徑為7～9 nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35 000 bp，兩端各有長約100 bp的反向重復序列。由于每條DNA鏈的5'端同相對分子質量為55X103Da的蛋白質分子共價結合，可以出現(xiàn)雙鏈DNA的環(huán)狀結構。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,腸道腺病毒腺病毒對呼吸道、胃腸道、尿道和膀胱、

13、眼、肝臟等均可感染，人腺病毒約1/3的已知血清型通常與人類疾病相關，但一種血清型可引起不同的臨床疾患；相反，不同血清型也可引起同一種疾患。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,腸道腺病毒胃腸炎許多腺病毒在腸道細胞中復制，隨糞便排出，但大多血清型與胃腸道疾病無關。而40型和41型腺病毒可引起嬰幼兒與年少（4歲以下）兒童的胃腸炎，致腹痛、腹瀉。C組腺病毒能引起某些嬰幼兒腸套疊。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,腸道腺病毒引起其他疾患腺病毒11、12型能

14、引起兒童急性出血性膀胱炎，尿中出現(xiàn)病毒。37型可引起女性宮頸炎和男性尿道炎，常由性傳播感染。在免疫功能低下者可引起偶發(fā)或嚴重的病毒感染，尤其在器官移植病人中發(fā)生嚴重呼吸道感染和病毒性肝炎，多由1、5和7型腺病毒引起。艾滋病患者可感染多種血清型腺病毒，并能出現(xiàn)抗原性介于中間的雜合型毒株，而且常為致死性腺病毒感染。主要原因是腺病毒的E1A蛋白可反式激活HIV的轉錄，加速HIV的復制。臨床發(fā)現(xiàn)37%的艾滋病患者病毒性腹瀉是由腺病毒所致。,病毒

15、性腹瀉診斷臨床意義,腸道腺病毒腺病毒感染后可獲得對同型的持久免疫力與絕大多數(shù)呼吸道感染的病原相比，機體對腺病毒的再感染能產(chǎn)生有效的免疫。起保護作用的是體內(nèi)產(chǎn)生的循環(huán)中和抗體。正常的健康成人一般也具有多型的抗體。約40%～60%的6～15歲的人具有1、2和5型中和抗體，但3、4和7型抗體很少。母親的抗體能保護嬰兒免除嚴重的腺病毒呼吸道感染。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒諾如病毒，又稱諾瓦克病毒（Norwalk Viruses，N

16、V）是人類杯狀病毒科(Human Calicivirus，HuCV)中諾如病毒（Norovirus,NV）屬的原型代表株。它是一組形態(tài)相似、抗原性略有不同的病毒顆粒。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒糞口途徑傳染，水源、食物污染易導致爆發(fā)流行潛伏期1~2天，癥狀持續(xù)1~2天，惡心嘔吐腹部痙攣性腹瀉，普遍感到病情嚴重，一日內(nèi)多次劇烈嘔吐預后良好抗體沒有免疫作用，可反復感染,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒諾如病毒最早是從196

17、8年在美國諾瓦克市暴發(fā)的一次急性腹瀉患者糞便中分離的病原。2002年8月第八屆國際病毒命名委員會批準名稱為諾如病毒，它與在日本發(fā)現(xiàn)的札幌樣病毒，合稱為人類杯狀病毒。諾如病毒感染性腹瀉在全世界范圍內(nèi)均有流行，全年均可發(fā)生感染，感染對象主要是成人和學齡兒童，寒冷季節(jié)呈現(xiàn)高發(fā)。美國每年在所有的非細菌性腹瀉暴發(fā)中，60-90%是由諾如病毒引起。荷蘭、英國、日本、澳大利亞等發(fā)達國家也都有類似結果。在中國5歲以下腹瀉兒童中，諾如病毒檢出率為15%

18、左右，血清抗體水平調查表明中國人群中諾如病毒的感染亦十分普遍。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒“諾如病毒”感染性腹瀉屬于自限性疾病，沒有疫苗和特效藥物，公眾搞好個人衛(wèi)生、食品衛(wèi)生和飲水衛(wèi)生是預防本病的關鍵，要養(yǎng)成勤洗手、不喝生水、生熟食物分開，避免交叉污染等健康生活習慣。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒諾如病毒遺傳高度變異，在同一時期和同一社區(qū)內(nèi)可能存在遺傳特性不同的毒株流行。諾如病毒抗體沒有顯著的保護作用，尤其是沒有長期免疫保

19、護作用，極易造成反復感染。諾如病毒有許多共同特征：直徑約為26～35nm，無包膜，表面粗糙，球形，呈二十面體對稱；從急性胃腸炎病人的糞便中分離，不能在細胞或組織中培養(yǎng)，也沒有合適的動物模型；基因組為單股正鏈RNA；在氯化銫密度梯度中的浮力密度為1.36～1.41g/cm3；電鏡下缺乏顯著的形態(tài)學特征，負染色電鏡照片顯示，NV是具有典型的羽狀外緣，表面有凹痕的小圓狀結構病毒。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒諾如病毒基因組全長約7.7

20、kb，包含3個開放閱讀框（Open　readding　frames，ORFs）。ORF1編碼非結構蛋白，包括RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）；ORF2和ORF3分別編碼主要（VP1）和次要（VP2）衣殼蛋白。VP1蛋白結構上可分為S和P區(qū)兩個相鄰的區(qū)域，其中S區(qū)形成內(nèi)殼，構成VP1的底座；P區(qū)形成拱樣結構突出于內(nèi)殼外。P區(qū)可進一步分為P1和P2兩個亞區(qū)，后者位于VP1的最外層，高度變異，

21、目前認為是免疫識別和受體結合的關鍵部位。ORF1/ORF2的重組及P2區(qū)的變異大大豐富了NV的遺傳多樣性。根據(jù)VP1序列的同源性，諾如病毒可分為GI~GV五個基因群（Genogroup），其中引起人類感染的主要是GI和GII群，基因群可進一步分為不同的基因型（Genotype）。自1995~1996年諾如病毒首次導致世界性大流行以來，GII群中的第4基因型GII.4，一直在世界范圍內(nèi)的流行中占據(jù)主導地位，且?guī)缀趺扛魞?、三年，GII.4便

22、會引發(fā)一次大范圍流行，同時出現(xiàn)一種新的變異株。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒傳播途徑諾如病毒感染性強，以腸道傳播為主，可通過污染的水源、食物、物品、空氣等傳播，常在社區(qū)、學校、餐館、醫(yī)院、托兒所、孤老院及軍隊等處引起集體暴發(fā)。疾控專家稱，病程為自限性，一般2～3天即可恢復。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒感染者糞便和嘔吐物中可以發(fā)現(xiàn)諾如病毒，可以通過幾種方式感染諾如病毒：1、食用諾如病毒污染的食物或飲用諾如病毒污染的飲料；

23、 因為病毒很小，而且攝入不到100個病毒就能使人發(fā)病。接觸諾如病毒污染的物體或表面，然后手接觸到口。2、直接接觸感染者，如照顧病人、與病人共餐或使用相同的餐具也可引起傳播。直接接觸到感染者(如照顧病人，與病人同餐或使用相同的餐具)。3、食物可以被污染的手、嘔吐物或糞便污染的物體表面直接污染，或者通過附近嘔吐物細小飛沫污染。盡管病毒在人體外很難繁殖，但是一旦存在食品或水中，就能引起疾病。[5] 4、有些食品在送至飯店或商店前可能被污

24、染。一些暴發(fā)是由于食用從污染的水中捕獲的牡蠣。其它產(chǎn)品如色拉和冰凍水果也可能在來源地被污染。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,諾如病毒“諾如病毒”感染性腹瀉是一種急性腸道傳染病，由“諾如病毒”引發(fā)，具有發(fā)病急、傳播速度快、涉及范圍廣等特點，癥狀多表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉。潛伏期多在24～48h，最短12h，最長72h。感染者發(fā)病突然，主要癥狀為惡心、嘔吐、發(fā)熱、腹痛和腹瀉。兒童患者嘔吐普遍，成人患者腹瀉為多，24h內(nèi)腹瀉4～8次，糞便為稀水便或水樣

25、便，無黏液膿血。大便常規(guī)鏡檢WBC<15，未見RBC。原發(fā)感染患者的嘔吐癥狀明顯多于續(xù)發(fā)感染者，有些感染者僅表現(xiàn)出嘔吐癥狀。此外，也可見頭痛、寒顫和肌肉痛等癥狀，嚴重者可出現(xiàn)脫水癥狀。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,病毒性腹瀉診斷臨床意義,,病毒性腹瀉診斷臨床意義,星狀病毒人星狀病毒于1975年從腹瀉嬰兒糞便中分離得到，球形，直徑28-35nm，無包膜，電鏡下表面結構呈星形，有5～6個角。核酸為單正鏈RNA，7.0kb，兩端為非編碼區(qū)

26、，中間有三個重疊的開放讀碼框架,病毒性腹瀉診斷臨床意義,星狀病毒該病毒呈世界性分布，糞-口傳播，是引起嬰幼兒、老年人及免疫功能低下者急性病毒性腸炎的重要病原之一，其致病性已日益受到重視，人類感染腺病毒主要癥狀是嚴重腹瀉，伴隨發(fā)熱、惡心、嘔吐。本病為自愈性疾病，大部分患者在出現(xiàn)癥狀2-3天時，癥狀會逐漸減輕，但也有極少數(shù)癥狀加重，造成脫水。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,預防目前使用的疫苗僅有用于預防雞星狀病毒疾病，為滅活苗。人類星狀病毒疾

27、病的疫苗至今沒有研制成功。但加強鍛煉有利于抵抗該類疾病。,病毒性腹瀉診斷臨床意義,星狀病毒冬季多發(fā)潛伏期3~4天，癥狀期3~5天癥狀輕，少見脫水與遷延性腹瀉有關,病毒性腹瀉診斷臨床意義,為流行病學監(jiān)測積累資料在人群中的傳播規(guī)律，為臨床醫(yī)生提供相對可靠的病原體感染譜，為經(jīng)驗性診斷和治療提供科學依據(jù)制定針對性的公共衛(wèi)生應對策略： 隔離傳染源： 切斷傳播途徑：環(huán)境衛(wèi)生，個人衛(wèi)生，認真洗手等等 保護易感人群：疫苗

28、 明確病因學診斷可以消除不必要的恐慌：尤其是暴發(fā)疫情,病毒性腹瀉診斷臨床意義,為科學研究提供可靠數(shù)據(jù)科研需要大量的基礎數(shù)據(jù)的支持，臨床和流行病學資料的積累，促進研究工作的深入開展為提高醫(yī)療單位、相關科室的科研水平提供工具、方法學保證,Part2 熒光免疫法及優(yōu)勢,臨床常見的病原學檢測方法,免疫學方法，因檢測準確、速度快、應用面廣得到臨床門診青睞！,臨床常見的病原學檢測方法,免疫學方法分很多種，包括：酶聯(lián)免疫檢測、膠體金法、

29、 熒光免疫法。,臨床常見的病原學檢測方法,臨床常見的病原學檢測方法,酶聯(lián)免疫檢測方法技術特點 技術特點是用酶來標記特定的抗體，在檢測過程中，如果樣本中有相應的病毒，帶有酶標記的抗體就會與其結合，利用酶的催化作用，就可以檢測出病毒。優(yōu)缺點 酶聯(lián)免疫檢測方法具有非常好的優(yōu)點，靈敏度高，檢測準確；缺點是操作相對復雜，一種試劑只能檢測一種病毒，檢測時間較長；尤其是對腹瀉病毒的檢測具有很大的缺點，因為，酶聯(lián)免疫檢測試劑一般一個檢測板上有9

30、6個試劑位，而這96個試劑位不能獨立使用，醫(yī)院為了降低檢測成本，一般都會積累樣本到一定數(shù)量才進行項目檢測，而對于腹瀉病人來說，需要快速進行檢測，因此，該方法不能夠適應腹瀉病毒快速檢測的要求。,臨床常見的病原學檢測方法,膠體金方法技術特點：基于免疫金染色法技術開發(fā)的試劑盒技術特點是用特定直徑的膠體金顆粒來標記病毒抗體，在檢測過程中分，如果樣本中有病毒，就會與金標記的抗體進行結合，使其分子大小和分子量發(fā)生改變，同時顏色也會發(fā)生相應的變化，

31、可以用肉眼觀察來判斷病毒類型。優(yōu)缺點：優(yōu)點是簡便，迅速；膠體金的技術缺點是自動化水平低，靈敏度相對較低，主要是肉眼判別檢測結果，因此檢測結果容易受到人為因素干擾，特別是低濃度樣本更容易產(chǎn)生誤判，同時結果穩(wěn)定時間過短，假陽性率高。,臨床常見的病原學檢測方法,熒光免疫法技術特點 ： 利用免疫層析技術，采用雙抗體夾心法檢測腹瀉病毒的抗原。當待測樣本加入測試卡加樣孔后，待測樣本中病毒抗原與熒光標記的抗體形成反應復合物，在層析作用下，反應復

32、合物沿硝酸纖維膜向前移動，分別被硝酸纖維膜檢測區(qū)上預先包被的單克隆抗體捕獲，在檢測區(qū)上形成反應帶，使用熒光免疫分析儀檢測出反應線上的熒光值，當熒光值等于或高于檢出限時，顯示為陽性，當熒光值低于檢出限時顯示為陰性，從而實現(xiàn)檢測病毒的目的。優(yōu)缺點：優(yōu)點是半自動，簡單、快速、多病毒聯(lián)合檢測；檢測結果半定量，避免人為肉眼主觀誤讀，穩(wěn)定時間比膠體金多一倍；方便連接醫(yī)院LIS、HIS系統(tǒng)。,檢測原理---雙抗體夾心法,熒光免疫法（雙抗體夾心法）,