豬流行性腹瀉病毒(PEDV)及其抗體檢測方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠狀病毒屬豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬的一種以腹瀉、嘔吐和脫水為主要臨床特征的高度接觸性傳染病。豬流行性腹瀉無論是流行病學(xué)特性、臨床癥狀還是小腸的病理變化都與豬傳染性胃腸炎(TGE)和豬輪狀(PR)十分相似，單憑臨床經(jīng)驗(yàn)和組織病變只能初步診斷。目前，還沒有有效的檢測方法區(qū)分這三種病毒。近年

2、來又由于豬腹瀉頻繁爆發(fā)、得不到有效控制，已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立優(yōu)化快速、準(zhǔn)確、簡便的檢測方法對于PEDV分子生物學(xué)研究及臨床防制都有重要意義。
　　 研究建立了PEDV檢測的RT-PCR以及熒光定量PCR方法;PEDV抗體檢測的IFA方法和相對定量中和試驗(yàn)方法。
　　 PEDV檢測的RT-PCR:本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank已登錄的PEDV-ORF3基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成一對特異性引

3、物，并進(jìn)行條件優(yōu)化，擴(kuò)增PEDV-ORF3全長基因，將片段與載體pMD18-T連接并轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，大量提取質(zhì)粒，測序并分析。建立的RT-PCR方法，通過優(yōu)化退火溫度，確定了最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，退火溫度確定在52-55℃，敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測到初始模板中1.86pg的RNA;特異性實(shí)驗(yàn)中TGEV、PRV、PRRSV、HEV及陰性對照均為陰性。臨床樣品檢測陽性率達(dá)80％。
　　 PEDV檢測熒光定量PCR方法:根據(jù)G

4、enBank已登錄的PEDV M基因，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)合成一對特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增出特異性目的片段，目的片段與載體pMD18-T連接并轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細(xì)胞，大量提取質(zhì)粒，酶切鑒定。重組質(zhì)粒測濃度并根據(jù)公式計(jì)算拷貝數(shù)。梯度稀釋質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)品，建立PEDV標(biāo)準(zhǔn)曲線且線性關(guān)系良好，R2=0.997，建立PEDV-M熒光定量PCR方法，并通過優(yōu)化條件，確定反應(yīng)程序和體系。敏感性實(shí)驗(yàn)可檢測到3.168copies/μL

5、的模板cDNA。特異性實(shí)驗(yàn)中TGEV、PRV、PRRSV、HEV陰性對照均為陰性，陽性樣則出現(xiàn)目的條帶。重復(fù)性試驗(yàn)中，批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)其變異系數(shù)都小于2％。臨床樣品檢測結(jié)果陽性率達(dá)98％。
　　 PEDV抗體檢測的IFA方法:將適應(yīng)于PEDV體外培養(yǎng)的LR7細(xì)胞鋪于24孔板，24h后，按MOI=0.1鋪上病毒，于37℃病毒吸附1h，棄去病毒液，24-36h后加入一抗和二抗，并設(shè)陰性血清對照、無一抗的病毒對照和正常細(xì)胞對照，熒光

6、顯微鏡下觀察。以建立免疫熒光方法。結(jié)果:可在顯微鏡下觀察到特異的熒光，且陰性血清對照、無一抗的病毒對照和正常細(xì)胞對照均無特異性熒光出現(xiàn)。
　　 PEDV抗體檢測的相對定量中和試驗(yàn)方法:將不同稀釋度的陽性血清與插入GFP發(fā)光基團(tuán)的PEDV病毒37℃中和30min，鋪于長滿VERO細(xì)胞的24孔板，12h后熒光顯微鏡下觀察，用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解下來后用TBS-380微型熒光計(jì)測的熒光值，建立線性關(guān)系，建立微量中和實(shí)驗(yàn)相對定量血清抗體