蛋白表達技術(shù)

1、蛋白表達技術(shù),蛋白表達技術(shù),,,蛋白表達涵義,,蛋白表達系統(tǒng)組成,,原核表達,,真核表達,無細胞表達,蛋白表達的涵義,,蛋白表達是指用模式生物如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù),在基因工程技術(shù)中占有核心地位。,一、原核表達系統(tǒng),大腸桿菌是基因工程研究中采用最多的原核表達體系。1977 年，Itakura 等成功地在 E. coli 中表達了一種哺乳動物的肽類激素 － 生長激素抑制素，從而首次實現(xiàn)了外

2、源基因在原核細胞中的體外表達。這被認(rèn)為是基因工程發(fā)展史上的一座里程碑。優(yōu)越性：①對大腸桿菌的基礎(chǔ)生物學(xué)、分子遺傳學(xué)等背景知識和基因表達的調(diào)控機理已有了深刻了解；②商品化的載體和菌株種類非常齊全；③表達效率高；④易培養(yǎng)，成本低。,缺點：①因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體；②蛋白質(zhì)不能糖基化；③其內(nèi)毒素很難除去。,Factors in E.coli protein expression,一個蛋白要成功的在E.c

3、oli系統(tǒng)表達，就是要根據(jù)表達目的在載體，菌株和培養(yǎng)條件三個主要因素之間找到一個理想的結(jié)合點。,表達載體,,表達系統(tǒng)中最重要的元件是表達載體，表達載體應(yīng)當(dāng)具有表達量高、穩(wěn)定性好、適用范圍廣等優(yōu)點。表達載體主要包括啟動子、表達閱讀框、終止子、復(fù)制起 點 以 及 抗 性 篩 選 標(biāo) 記 等 重 要元件,,近年來的研究表明，在科研和工業(yè)上被廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達載體主要有 pGE 系列、pQE 系和 pET 系列，其中目前被廣泛應(yīng)用的高效表達

4、載體是 pET。,復(fù)制起始點：保證載體可以正確復(fù)制和增殖，決定質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)?？寺≥d體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子通常表達載體都會選用高拷貝的復(fù)制子 選擇性基因-篩選標(biāo)記：藍白斑篩選（主要用于克?。I養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。,復(fù)制起始點：保證載體可以正確復(fù)制和增殖，決定質(zhì)粒載體在宿主中的拷貝數(shù)。克隆載體常采用拷貝數(shù)低、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)制的復(fù)制子通常表達載體都會選用

5、高拷貝的復(fù)制子 選擇性基因-篩選標(biāo)記：藍白斑篩選（主要用于克?。?、營養(yǎng)缺陷性篩選、抗生素篩選（青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性、四環(huán)素抗性等）。多克隆位點：DNA載體序列上人工合成的一段序列，含有多個限制內(nèi)切酶識別位點。能為外源DNA提供多種可插入的位置或插入方案。,,啟動子：能被RNA聚合酶識別、結(jié)合并啟動基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列轉(zhuǎn)錄形式：組成型、誘導(dǎo)型強弱：取決于-35區(qū)和-10區(qū)的堿基組成及其間隔序列。—表達載體通

6、常選用強啟動子以提高表達量，但弱啟動子也有其優(yōu)點，如降低本底表達、增加可溶表達、表達小量伴侶蛋白等。,T7啟動子----最常用啟動子基于 T7 RNA 聚合酶及其強啟動子之間的特異性和轉(zhuǎn)錄的高效性建立的 pET 系統(tǒng)( No-vagen) 是最常用的 E. coli 表達系統(tǒng)。T7 NAP 機制在誘導(dǎo)蛋白表達時，幾乎所有的細胞資源都用于表達目的蛋白，而且表達產(chǎn)物產(chǎn)量也特別高。,終止子：終止點前含有一段7-20bp的回文序列，可以保護m

7、RNA在核外不被降解，顯著延長mRNA的壽命，由此提高重組蛋白的表達量。融合標(biāo)簽：利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和純化等。標(biāo)簽位置的選擇：----N端融合：易于構(gòu)建。終止密碼子來自載體基因，表達量高提前終止會干擾純化二級翻譯起始，不影響純化---- C端融合：構(gòu)建時注意避免移碼，基因不能自帶終止密碼子，提前終止不影響純化，二級翻譯起始會干擾純化常用融合標(biāo)簽

8、His·TagpET系統(tǒng) GST·TagpGEX系統(tǒng) MBP·TagpMal系統(tǒng),,TrxHISHis6是指六個組氨酸殘基組成的融合標(biāo)簽，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對重組蛋白進行分離純化。 優(yōu)點：標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能；

9、His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下（純化疏水性強的蛋白）或變性條件（純化包涵體蛋白）下純化，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進行金屬螯和親和層析復(fù)性；His標(biāo)簽融合蛋白也被用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究；His標(biāo)簽免疫原性相對較低，可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫并制備抗體?？蓱?yīng)用于多種表達系統(tǒng)，純化的條件溫和；可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙

10、親和標(biāo)簽。,Flag標(biāo)簽蛋白Flag標(biāo)簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構(gòu)建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統(tǒng)中表達效率更高。 優(yōu)點：FLAG作為融合表達標(biāo)簽，其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。融合FLAG的目的蛋白，可以直接通過FLAG進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并

11、且純化效率高。FLAG作為標(biāo)簽蛋白，其可以被抗FLAG的抗體識別，這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定。融合在N端的FLAG，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現(xiàn)FLAG標(biāo)簽已廣泛的應(yīng)用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。,MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE

12、基因編碼。優(yōu)點：MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP標(biāo)簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標(biāo)簽如果蛋白在細菌中表達，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。 純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進行洗脫。結(jié)合親和力在微摩爾范圍?？捎肕BP抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。,GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)GST(谷胱甘肽

13、巰基轉(zhuǎn)移酶) 標(biāo)簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26KD?？芍苯訌募毦呀庖褐欣煤羞€原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。優(yōu)點：作為高度可溶的蛋白，可增加外源蛋白的可溶性；在大多數(shù)情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的?？稍诖竽c桿菌中大量表達，起到提高表達量的作用。標(biāo)簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生

14、物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測：可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。,常用表達載體系統(tǒng),,,目的蛋白表達形式及在細胞中的定位,,蛋白表達形式,,分泌蛋白:采用信號肽序列可以將蛋白直接分泌到細菌的周質(zhì)腔去。,,,可溶性蛋白:目的蛋白與一段融合標(biāo)簽序列 （FLAG、His － Tag、GFP

15、 等) 融合表達而形成,包涵體蛋白 :包涵體蛋白的形成是由于肽鏈折疊過程中，部分折疊中間態(tài)發(fā)生特異性錯誤聚合，不能形成成熟的天然或完全解鏈的蛋白所致,,宿主菌的選擇,用于克隆的宿主菌 K12系列NovaBlue，JM109以及DH5 a。特點：recA–endA–型，轉(zhuǎn)化效率很高，且質(zhì)粒產(chǎn)量高，適合用于保存帶有克隆目的基因的pET載體。用于表達的宿主菌所有 B 型菌株，B834，BL21，BLR，Origami B，Rosett

16、a及Tuner特點：都缺乏純化過程中降解蛋白的lon蛋白酶及 ompT 外膜蛋白酶。目的蛋白在這些菌株中的穩(wěn)定性要高于帶有這些蛋白酶的菌株，BL21(DE3)是用得最多的表達菌,E.coli宿主菌,,,表達條件優(yōu)化,,,增加可溶性和折疊,選擇大腸桿菌偏愛密碼子,毒性基因及質(zhì)粒穩(wěn)定性,合適載體與宿主菌組合,表達條件優(yōu)化,毒基因：基因表達產(chǎn)物——即目的蛋白，影響宿主生長（“毒性”）,例1:載體對表達的影響,pET32,BL21(DE3),

17、表達的蛋白:Trx-His6-EK-IFN(MW35KD),pET43,BL21(DE3),表達的蛋白:Nus-His6-S Tag-EK-IFN(MW78KD),誘導(dǎo)后,破菌上清,破菌沉淀,誘導(dǎo)前,誘導(dǎo)前,誘導(dǎo)后,破菌沉淀,破菌上清,破菌上清,例2:宿主菌對表達的影響,Tissue plasminogen activator (tPA,9 disulfide bonds) was expressed in three differen

18、t hosts. 10 mg of soluble protein was spotted onto fibrin agarose plates and incubated for 24 h at 37°C. Zone of clearing measures biological activity of tPA.,pET32,例3:表達條件對表達的影響,pET21,BL21(DE3)-RIL,表達的蛋白:His6-REIIB

19、P(MW67KD),U:Uninduced crude extractI:Crude extract after inducedS:Lysis supertanantP:Lysis precipitation,大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究新進展近幾年來，對大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究，已經(jīng)從最初的構(gòu)建不同的表達載體建立新的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)移為完善現(xiàn)有的表達系統(tǒng)，解決表達系統(tǒng)中的各種缺陷，包括: 采用 RosettaTM( No-vagen) 代

20、替 BL21 菌株來增強含有 E. coli 稀有密碼子的重組蛋白的表達水平; 采用 BL21( DE3) 、BL21 ( DE3) pLysS 以及BL21( DE3) pLysE ( Invitrogen) 彌補高濃度的胞內(nèi)酶環(huán)境對具有生物活性的目的蛋白在 E. coli 中表達的抑制等。,最近幾年來，研究人員逐步將研究重點放在通過將一些具有活性的小蛋白與目的蛋白融合，進而促進目的蛋白在 E. coli中的表達，或者通過改造某種現(xiàn)有

21、的表達載體，通過將各種促溶標(biāo)簽與載體融合，進而使得某些在 E. coli 中不表達的蛋白得以表達或使原本以包涵體形式表達的蛋白以可溶性形式表達。這些標(biāo)簽包括 FLAG、MBP、GST、thioredoxin 等。,其他原核表達式系統(tǒng),乳酸乳球菌表達系統(tǒng) 乳酸菌是革蘭氏陽性菌，膜單一，在大量膜蛋白的表達方而提供了革蘭氏陰性菌無法比擬的優(yōu)勢，原因是革蘭氏陰性菌具有內(nèi)外膜并覆蓋著厚厚的、剛性的肚聚糖層的內(nèi)表而周質(zhì)空間影響蛋白質(zhì)的表達，而

22、蛋白在乳酸乳球菌中的表達是通過融合Mistic到目標(biāo)膜蛋白而加以改善，提高其表達量。,芽袍桿菌表達系統(tǒng) 芽抱桿菌(Bacillus)也屬于革蘭氏陽性菌。橋石短芽抱桿菌和枯草芽抱桿菌表達系統(tǒng)由Takara, MoBiTec公司開發(fā)與提供。芽抱桿菌能過表達并且能分泌外源蛋白到培養(yǎng)基中，這適合分泌型蛋白的生產(chǎn)，如細胞因子或需要形成復(fù)雜二硫鍵的外源蛋白。,,真核細胞表達系統(tǒng),為了克服原核表達系統(tǒng)的不足，許多學(xué)者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入到真核

23、基因調(diào)控領(lǐng)域?；蚬こ坛Ｓ玫恼婧吮磉_系統(tǒng)有: 酵母、昆蟲細胞、動物細胞、植物細胞,酵母表達系統(tǒng),酵母是一種低等的單細胞真核生物，它既具有原核生物易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作等特點，同時又具有真核生物蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后飾等的功能。目前工業(yè)生產(chǎn)中最重要的外源蛋白表達系統(tǒng)是酵母表達系統(tǒng)。優(yōu)越性：①蛋白可糖基化，有相對正確的天然結(jié)構(gòu)，可很好的生產(chǎn)分泌型蛋白；②表達載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中同源的序列，因而比較容

24、易整合入酵母染色體中，實現(xiàn)高效率表達；③表達載體都為E.coli/Pichia Pastoris的穿梭載體，可在獲得克隆后采用E.coli細胞大量擴增。④易培養(yǎng)，成本低,可高密度發(fā)酵。,缺點：①糖基化與哺乳動物有所差別；②培養(yǎng)上清多糖濃度高，不利于純化。,酵母表達系統(tǒng)發(fā)展,第 39 頁,釀酒酵母,甲基營養(yǎng)型酵母,粟酒裂殖酵母,,,長久以來被稱為真核生物中的“大腸桿菌”，最早應(yīng)用于酵母基因的克隆和表達。目前利用釀酒酵母為宿主細胞

25、表達了多種外源基因，如乙型肝炎疫苗、人胰島素、人粒細胞集落刺激因子、人血管抑制素等。,1983 年，美國 Wegner 等人最先發(fā)展了以甲基營養(yǎng)型酵母 為代表的第二代酵母表達系統(tǒng)。甲基營養(yǎng)型酵母包括: 畢赤酵母、漢森酵母、假絲酵母。以 畢赤巴斯德酵母為宿主的外源基因表達系統(tǒng)近年來發(fā)展最為迅速，應(yīng)用也最為廣泛。,酵母細胞中生理特性最接近高等生物的一種，其染色體結(jié)構(gòu)和功能，細胞循環(huán)的控制，RNA 剪接蛋白表達分泌機制及翻譯后修飾等都與哺乳動

26、物細胞很相似。近年來，有學(xué)者提出它可能也是潛在的能有效表達真核膜蛋白的表達系統(tǒng).,甲醇酵母表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的酵母表達系統(tǒng)，以Pichia Pastoris應(yīng)用最多。,畢赤酵母表達系統(tǒng)模式載體,甲醇氧化酶啟動子A、目前已發(fā)現(xiàn)的、最強的真核啟動子B、嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控型啟動子 AOX1：葡萄糖和甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo) MOX：葡萄糖阻遏、甘油脫阻遏、甲醇誘導(dǎo),,甲醇酵母的表達載體為整合型質(zhì)粒，載體中含有與酵母染色體中

27、同源的序列，因而比較容易整合入酵母染色體中。甲醇酵母一般先在含甘油的培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)至高濃度。再以甲醇為碳源。誘導(dǎo)表達外源蛋白。這樣可以大大提高表達產(chǎn)量。利用甲醇酵母表達外源性蛋白質(zhì)其產(chǎn)量往往可達克級。與釀酒酵母相比其翻譯后的加工更接近哺乳動物細胞，不會發(fā)生超糖基化。,近年來，用該表達系統(tǒng)成功表達的蛋白達到了300多種，表達的蛋白主要包括基因工程疫苗，如乙肝疫苗及一些來自動植物和細菌的各種酶、膜受體蛋白、抗原和抗體及一些用來研究晶

28、體結(jié)構(gòu)的蛋白等。同時，該系統(tǒng)作為一種基礎(chǔ)研究的模型系統(tǒng)在分子生物學(xué)領(lǐng)域也發(fā)揮了越來越重要的作用，如用該系統(tǒng)進行過氧化物酶體的輸入和組裝及真核細胞的分泌途徑和功能等方面的研究。目前國內(nèi)也有多種蛋白在該系統(tǒng)中獲得了高效表達，如人白蛋白、人胰島素、干擾素、乙肝表面抗原、集落刺激因子等幾十種蛋白質(zhì)。,昆蟲細胞表達系統(tǒng)是目前國內(nèi)外很推崇的真核表達系統(tǒng)。依托桿狀病毒結(jié)構(gòu)基因中多角體蛋白的強啟動子而構(gòu)建的表達載體，有效甚至高水平地使很多真核目的基因得

29、到表達。利用重組桿狀病毒在昆蟲細胞體系中表達外源蛋白是目前較為流行的表達方式。優(yōu)越性：①重組蛋白具有完整的生物學(xué)功能，如蛋白的正確折疊、二硫鍵的搭配；②可容納較大片段的外源DNA插入，因此是表達大片段DNA的理想載體；③可進行分泌表達。,缺點：①糖基化與哺乳動物有所差別；②表達量有限；③作為藥物宿主細胞未被FDA認(rèn)可； ④培養(yǎng)成本高。,2.昆蟲表達系統(tǒng),桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb表達系

30、統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體→共轉(zhuǎn)染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒,桿狀病毒載體的構(gòu)建發(fā)展,3. 哺乳動物細胞表達表達系統(tǒng),當(dāng)前，哺乳動物細胞表達已成為生物藥物生產(chǎn)的重要技術(shù)。哺乳動物細胞常用于表達高活性的人源重組蛋白。優(yōu)越性：①糖基化與人源蛋白一致；②能表達天然結(jié)構(gòu)的完整蛋白，活性

31、很高；③可進行分泌表達。,缺點：①表達量低；②培養(yǎng)成本很高，操作繁瑣。,常用宿主細胞,表達栽體,哺乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。哺乳動物細胞表達載體必須包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標(biāo)記基因、終止子和多聚核苷酸信號等控制元件根據(jù)進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。,病毒載體:是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內(nèi)。常用的病毒載體有S

32、V40病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒桿狀病毒載體應(yīng)用于哺乳動物細胞的表達在近幾年頗受重視，這是因為它與其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢，如可通過昆蟲細胞大量制備病毒顆粒；可感染多種哺乳動物細胞，但在細胞內(nèi)無復(fù)制能力，生物安全度高；可插入高達38 kb的外源基因等。,質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復(fù)制能力，需整合于宿主細胞染色

33、體內(nèi)方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用 Sindbis virus(SV)、Scmliki Forest virus(sFV) 和痘苗病毒載體感染哺乳動物細胞表達的蛋白在結(jié)構(gòu)與功能上與天然哺乳動物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動物細胞獲得的外源蛋白占細胞總蛋白的；,附加體型載體則是在細胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機整合入

34、染色體，其外源基因的表達受插入位點 的影響，同時還可能會改變宿主細胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的 問題，但載體DNA在復(fù)制中容易發(fā)生突變或重排。,猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNASV40可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結(jié)合，從而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)

35、。 SV40感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。 SV40在裂解宿主細胞前的晚期狀態(tài)時，每個宿主細胞含有105個病毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效表達外源蛋白,SV40的生物學(xué)特性,SV40 DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建,重組的SV40 DNA分子必須經(jīng)過,包裝后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。為了盡量提,高SV40的裝載量，必須刪除一些基因,

36、片段，因此重組的SV40分子必須與野,生型病毒共感染受體細胞，才能形成,有感染力的重組病毒顆粒。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,,,,,pBR322,pBR322,,,SV40,pV2-GPT是一種SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其,中g(shù)pt為細菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該,載體曾被成功地用于在猴腎細胞中表

37、達有生物活性的兔b-珠蛋白.,人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，獨立于染色體而自主復(fù)制，每個宿主細胞最高可達500個拷貝,人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性,人乳多瘤病毒表達載體的構(gòu)建,BKV - E.coli 穿梭載體,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,刪除編碼病毒核

38、心蛋白和外殼蛋白的,基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成,穿梭載體，它不能整合，同時也不能,形成成熟的病毒顆粒裂解受體細胞。,安裝細胞色素P450 dioxin介導(dǎo)的增強,子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達。,SV40來源的啟動子控制Neor 標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。,以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。,利用SV40 DNA載體表達外源基因的程序,SV40 載體,病毒晚期基

39、因啟動子,,篩選標(biāo)記,ori,缺陷的SV40 輔助病毒,,去除細菌序列,插入外源基因,重組分子,,分離病毒DNA,,,,,轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,篩選,增殖,感染,通過強化基因轉(zhuǎn)錄高效表達外源基因,在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟,,,,,,mRNA前體,,,,AAAAAAAAA,mRNA,動子以及有效的翻譯元件，是使外源基,因高效表達的一種手段，如：,細胞巨化病毒CMV的啟動子,動

40、物珠蛋白基因的內(nèi)含子,SV40的終止子和polyA化信號序列,絕大多數(shù)哺乳動物細胞的表達型載體,上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因為mRNA前體的剪,切能促進成熟mRNA向胞質(zhì)的運輸，有利,于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。,瞬時轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,哺乳動物細胞生產(chǎn)蛋白的方式有兩種：瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染的特點是短期快速表達，滿足蛋白的小量制備。細胞瞬時轉(zhuǎn)染表達能夠快速靈活的制備重組蛋白，細胞在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)即可收獲并進行分析。,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染通過穩(wěn)

41、定細胞系能夠滿足蛋白的大量、長期生產(chǎn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的是將外源基因整合到細胞自身基因組上，隨著細胞的生長分裂外源基因可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達，同時經(jīng)過抗生素加壓篩選，最終得到能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達蛋白的細胞株。,發(fā)展歷史,1987年FDA批準(zhǔn)了基因泰克公司生產(chǎn)的組織型纖溶酶原激活劑（tPA）, 世界上第一個哺乳動物細胞制備的重組蛋白質(zhì)藥物標(biāo)志著哺乳動物細胞制備重組蛋門時代的到來。經(jīng)過20多年的發(fā)展，哺乳動物細胞制備重組蛋白技術(shù)發(fā)生了巨大的變化。主要表現(xiàn)在

42、: (1) 細胞培養(yǎng)時間延長，由過去的7天延長至21天； (2) 細胞密度增加， 過去：1-2X106細胞／毫升， 現(xiàn)在：1-1.5X107細胞／毫升；,(3) 產(chǎn)量增加， 過去：10—20pg重組蛋白／細胞／天， 50一100mg重組蛋白／升， 現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白／細胞／天，

43、 1-5g重組蛋白／升。,迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進行臨床試驗，但在哺乳動物工程細胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：,b 干擾素g 干擾素,凝血因子VIII凝血因子IX,促紅細胞生成素（EPO）生長因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,單克隆抗體 CD4受體,組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體,大多數(shù)惡性淋巴瘤細胞表面

44、上都有一種特異性的糖蛋白campath，用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細胞瘤患者，效果良好。重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Neor,鼠金屬硫蛋白啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體輕鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pL,,,,,,,,,,,,,,,,dhfr,SV40啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體重鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pH,,,,,,,,,,,

45、,,,,,利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑,第一個由重組哺乳動物,dhfr,啟動子,人tPA cDNA,終止子,細胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白,是治療急性心肌梗塞的溶血,栓藥物：人組織纖溶酶原激,活劑（tPA）。同樣采用,DHFR-MTX系統(tǒng)表達，受體,細胞選用CHO系統(tǒng)。目前，,用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,信號肽編碼序列,此外，人tPA也可由重組大腸

46、桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。,利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人凝血因子VIII,凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來，血友病病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進行治療，然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛滋病而非血友病。 早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)

47、生產(chǎn)該藥物的進程。與tPA相似，人凝血因子VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過重組哺乳動物細胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。,,,,轉(zhuǎn)基因動物,以動物個體為基因受體的基因表達技術(shù)，并由于這種外源基因的導(dǎo)入而產(chǎn)生可以遺傳的變異.這些遺傳改變包括：外源DNA至少整合到一條染色體上由于外源DNA的插入使任一基因發(fā)生改變由于外源DNA的插入使染色體發(fā)生重排有意識的導(dǎo)入可以持久存在的

48、遺傳實體,在各種器官和細胞中，乳腺組織可以進行大規(guī)模的翻譯后修飾，并具有良好的滲透屏障。近年來，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的研究已經(jīng)成為生物工程領(lǐng)域研究的熱點，一般用來高效、高質(zhì)量生產(chǎn)具有生物活性的蛋白。但多數(shù)研究表明，乳腺特異性表達的成功率很低，蛋白在乳汁中的表達水平較低。,植物生物表達系統(tǒng),外源基因可以使用帶有分泌信號肽序列的植物體使重組蛋白分泌表達。利用植物做為生物反應(yīng)器生產(chǎn)的重組蛋白在折疊和組裝上與動物細胞更為相似，從而具有與高等

49、動物細胞表達的產(chǎn)物基本一致的免疫原性和生物活性，并且不會存在被動物、病原體污染的可能性。,植物能夠表達來自動物、細菌、病毒以及植物本身的蛋白質(zhì)易于大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)，且在基因表達與修飾及安全性方面有特別的優(yōu)勢，因此利用植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)的研究展現(xiàn)了極其誘人的前景。多種抗體、酶、激紊、血漿蛋白和疫苗等都已通過基因工程的手段在植物的葉、莖、根、果實、種子以及植物細胞和器官中得到表達，然而提取與純化始終是大規(guī)模利用植物生產(chǎn)重組蛋白的主要障礙。

50、,Doloressa等據(jù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號肽在蛋白質(zhì)合成中的作用，把3種重組蛋白，即嗜熱細菌來源的木聚糖酶、水母的綠色熒光蛋白和人胎盤分泌的堿性磷酸酶(SEAP)定位到質(zhì)外體中，通過根分泌和葉分泌途徑獲得表達，從而建立了兩種新的重組蛋白表達系統(tǒng)--植物根分泌和葉分泌，簡化了分離和純化程序，為利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了潛在的途徑。雖然利用植物表達、生產(chǎn)外源性蛋白起步較晚，但目前已經(jīng)能夠利用植物生產(chǎn)多種醫(yī)用、食用以及工業(yè)用蛋白

51、及酶制劑。,無細胞表達系統(tǒng),無細胞蛋蛋白合成系統(tǒng)是一種以外源DNA或mRNA為模板，利用細胞抽提物中的蛋白合成機器、蛋一折疊因子及其他相關(guān)酶系，通過添加氨基酸、T7聚合酶和能量物質(zhì)等來實現(xiàn)蛋白質(zhì)表達的體外系統(tǒng)。其不受細胞核（核酸DNA/RNA)、線粒體、細胞骨架等的干擾，能夠在體外快速、大量表達蛋白。,1958年，Zamecnik首次證明，從細胞抽提物中獲得的翻譯機器可以介導(dǎo)體外的蛋白的合成；1961年，Nirenberg和Mattha

52、ei利用蛋白質(zhì)的無細胞合成體系，以破譯遺傳密碼子。,體外無細胞蛋白表達系統(tǒng)分為原核和真核兩大類。原核系統(tǒng)以細菌裂解物為基礎(chǔ)，如大腸桿菌系統(tǒng)；真核系統(tǒng)以真核細胞裂解物為基礎(chǔ)，包括麥胚系統(tǒng)、昆蟲系統(tǒng)、兔網(wǎng)織紅細胞系統(tǒng)等。這一真正的“開放”系統(tǒng)，能夠特異性表達目的蛋白，產(chǎn)生的蛋白可用于蛋白質(zhì)功能檢測、結(jié)構(gòu)分析等下游實驗。該系統(tǒng)應(yīng)用至今，已成功表達超過2 萬種蛋白，其中包括13364 個人類的基因。,無細胞蛋白表達系統(tǒng)與傳統(tǒng)表達系統(tǒng)特點比

53、較,無細胞蛋白合成系統(tǒng)能夠表達其他表達系統(tǒng)很難表達的蛋白，如毒性蛋白、膜整合蛋白、生物活性肽。而且能更好的生產(chǎn)需要二硫鍵形成的外源蛋白，因為裂解物的氧化還原條件可使用添加劑或改變還原劑/氧化劑的比例進行調(diào)節(jié)。,主流的無細胞(cell free CF)表達策略為分層、分批提供新鮮組分到混合物中，消除混合物中副產(chǎn)物。在分批處理時，mRNA編碼的蛋白連續(xù)注入反應(yīng)物中，這可以提高產(chǎn)量，特別是當(dāng)反應(yīng)時間長、反應(yīng)規(guī)模大時，并且存在裂解液中核糖核酸酶

54、使靶標(biāo)mRNA降解可能性增加。,CF表達系統(tǒng)適用于膜蛋白的生產(chǎn)，溶解的膜蛋白在含有洗滌劑的CF反應(yīng)混合物中的表達可以重組到脂質(zhì)雙分子層中如脂質(zhì)體、雙層細胞和奈米圓盤。在這個過程中，在附帶脂質(zhì)清潔劑交換程序卜，自發(fā)的共轉(zhuǎn)化和翻譯后修飾方法被使用。,CF表達系統(tǒng)的易操作和高通量特性，能夠用于膜蛋白最佳增溶條件的篩選，缺點是不適合大量蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，因為蛋白表達水平比活宿主細胞的低，成木昂貴。,小結(jié)獲得具有大然結(jié)構(gòu)和足夠多的生物功能的蛋白質(zhì)

55、，以及發(fā)現(xiàn)新型蛋白分子對于實現(xiàn)藥物發(fā)現(xiàn)新突破尤為重要。重組蛋白技術(shù)使蛋白分子功能得以改善，蛋白純度有效提高。原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)、無細胞表達系統(tǒng)以及其他蛋白生產(chǎn)方法的應(yīng)用，雖然尚存缺點，但其獨有的優(yōu)勢應(yīng)該加以利用。,目前重組蛋白的表達和純化技術(shù)仍然需要克服困難并在研究過程中積累經(jīng)驗，及時汲取相關(guān)領(lǐng)域的研究進展，找出重組蛋白的制約因素，對癥下藥。隨著基因工程技術(shù)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，重組蛋白技術(shù)將會越來越成熟，作為藥物分子的靶標(biāo)蛋白