小鼠骨髓DC 2-DE技術(shù)體系建立及其蛋白質(zhì)表達(dá)分析.pdf

1、樹突狀細(xì)胞是機(jī)體中功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，既能直接激活初始型T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)早期特異性免疫應(yīng)答；又能誘導(dǎo)免疫耐受，具有強(qiáng)大的激活CTL及CD4+Th細(xì)胞的能力，控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)的過程，在免疫應(yīng)答中處于中心位置，已成為免疫學(xué)及相關(guān)學(xué)科的研究熱點(diǎn)。 髓系樹突狀細(xì)胞分化發(fā)育的各階段具有不同的功能特點(diǎn)。未成熟期樹突狀細(xì)胞可由粘附分子選擇素介導(dǎo)進(jìn)入炎癥組織，并具有極強(qiáng)的抗原內(nèi)吞和加工處理能力，但其激活初始T細(xì)胞的能力較弱。利用DC來

2、增強(qiáng)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫能力的研究，已成為腫瘤生物治療的重要課題。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外都已將其作為腫瘤疫苗應(yīng)用于基因治療，取得了很好的臨床效果。如果將抗原引入未成熟樹突狀細(xì)胞，使之發(fā)育為成熟細(xì)胞，則在臨床應(yīng)用上更為理想。 仙臺(tái)病毒載體是細(xì)胞質(zhì)型RNA載體，對(duì)各種動(dòng)物細(xì)胞有較高的感染效率；在理論上不存在改變細(xì)胞核內(nèi)染色體的危險(xiǎn)性，與以往的載體相比具有更高的安全性。仙臺(tái)病毒載體作為基因治療、基因疫苗、基因(蛋白質(zhì))功能分析及蛋白質(zhì)生產(chǎn)研究的

3、載體，受到許多學(xué)者的青睞。 本課題對(duì)小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了分析，通過雙向電泳和MALDI-TOFMS分析，運(yùn)用MS-Fit工具進(jìn)行鑒定；對(duì)仙臺(tái)病毒載體處理的成熟DC進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組分析，尋找差異蛋白；對(duì)DC所表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的生理作用以及它們相互間的作用進(jìn)行了分析和探討。研究結(jié)果如下： 1.以樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、宮頸癌CasKi細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞Bm5和e21為研究材料，在不同

4、條件下進(jìn)行2-DE，采用改進(jìn)的銀染法檢測(cè)蛋白斑點(diǎn)，所分離得到的蛋白點(diǎn)能夠滿足進(jìn)行質(zhì)譜分析的要求。 2.未成熟DC表達(dá)的蛋白質(zhì)用2-DE進(jìn)行分離，得到了約660個(gè)蛋白點(diǎn)，取其中118個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOFMS分析，獲得了87個(gè)蛋白點(diǎn)的PMF圖，經(jīng)鑒定、分析發(fā)現(xiàn)，其中與未成熟DC免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)有40個(gè)，占45.98％；與大分子代謝相關(guān)的有37個(gè)，占42.53％。 3.感染SeV后的DC表達(dá)蛋白經(jīng)質(zhì)譜分析為胞

5、苷脫氫酶、肌動(dòng)蛋白素、谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶、甲硫氨酸-tRNA甲酰轉(zhuǎn)移酶、ADP／ATP轉(zhuǎn)位酶 2、凋亡效應(yīng)子Caspase-4前體、肌動(dòng)蛋白、蛋白酶體p42亞基、腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)蛋白2、磷酸葡萄變位酶3、IL-1受體、熱休克蛋白70．2、葡萄糖調(diào)控蛋白前體、70kDa熱休克蛋白8、乙酸輔酶A連接酶2。 4.感染SeV-sfltl和Sev／AF后DC與未成熟DC相比較，未表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜分析為半胱氨酸蛋白酶抑制劑F的前體

6、、前折疊素的亞基2、膠質(zhì)成熟因子γ、肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(環(huán)孢素A結(jié)合蛋白)、鋅指蛋白9。其它蛋白質(zhì)只是在表達(dá)量上有所下調(diào)。 5.SeV、SeV／AF、SeV-sfltl分別感染未成熟DC，在感染后1、2、3、5、7天，檢測(cè)DC增殖、凋亡、表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，SeV、SeV／AF、SeV-sfltl感染后對(duì)DC的增殖、凋亡及細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 6.對(duì)未成熟DC表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子和凋亡因子的生物

7、功能進(jìn)行了探討。鋅指蛋白是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。凋亡因子Bcl-2和caspase在細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。熱休克蛋白在蛋白質(zhì)的折疊、定位以及細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中有著重要作用。 7.仙臺(tái)病毒載體對(duì)DC蛋白表達(dá)的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面：蛋白質(zhì)種類的的減少和表達(dá)量的下調(diào)。前者主要是因?yàn)椴《镜膹?fù)制序列所造成的，后者主要由載體攜帶的目的基因引起。仙臺(tái)病毒載體進(jìn)入DC后，RNA大量復(fù)制，結(jié)構(gòu)蛋白合成增加，導(dǎo)致

8、DC細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)合成減少。去除復(fù)制序列后，病毒RNA不能進(jìn)行復(fù)制，只能依靠轉(zhuǎn)入DC的RNA作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，因此DC的蛋白表達(dá)下調(diào)。 總之，本課題建立了適宜各種細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)分析的技術(shù)體系，特別是在蛋白質(zhì)的分離過程中，用銀染法檢測(cè)2-DE后凝膠上的蛋白斑點(diǎn)，這就可以減少樣品用量，對(duì)不易獲得的材料也能開展蛋白質(zhì)組研究。未成熟DC的蛋白質(zhì)表達(dá)分析得到了87個(gè)蛋白點(diǎn)，這對(duì)于深入理解DC在免疫系統(tǒng)中的作用具有重要意義。仙臺(tái)病毒載