ut對pq中毒后損傷肺成纖維細胞的修復作用探究

1、姓名：謝永鵬,烏司他丁對百草枯中毒后損傷肺成纖維細 胞的修復作用研究,內容介紹,立項依據(jù)與創(chuàng)新,實驗技術及過程,研究背景-百草枯簡介,百草枯(paraquat,PQ)，20%，250mL裝；是一種有機雜環(huán)類廣譜非選擇性接觸性除草劑及脫葉劑。PQ對人畜具有較強毒性，人口服致死量約為1～3g。中毒后致急性肺損傷及肺纖維化改變?yōu)槠涮禺惐憩F(xiàn)缺少特效解毒劑和能夠在血液或組織中與PQ結合的螯合劑，PQ

2、中毒的病死率高達60%～80%。,研究背景-烏司他丁簡介,烏司他丁 (Ulinastain ,UT)，本品是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種糖蛋白，由143個氨基酸組成，相對分子質量約6700。本品屬蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用。另具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子（MDF）產生，清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用。,

3、,研究背景-肺成纖維細胞,正常情況下，MRC-5存在精確調控，分泌的細胞外基質（ECM）處于動態(tài)平衡。膠原蛋白是主要的ECM蛋白，占肺干重1/5（Ⅰ、Ⅲ）。肺損傷后，MRC-5及膠原蛋白過度合成，參與病理修復。膠原蛋白的生成和沉積將導致肺纖維化,肺成纖維細胞,研究背景-結締組織生長因子（CTGF）,CTGF屬于TGF-β家族，作為TGF-β的下游因子，主要促進細胞增殖、粘附，ECM異常沉淀早期即刻蛋白，主要表達于活化的肺

4、纖維細胞，見于肺纖維變性早期，晚期極弱?？勺鳛槔w維化病變早期診斷標志物。促纖維化作用呈劑量依賴，可被抗CTGF抗體拮抗。,研究背景-細胞力學特性,力學特性（粘彈性）是細胞的一種本質屬性，細胞所處的生理/病理狀態(tài)、組織環(huán)境和力環(huán)境不同，所表現(xiàn)的力學特性也不盡相同。解釋一些組織器官的生理、病理變化以及解釋疾病的發(fā)病與治療機理等具有重要的意義。 目前為止，國內外尚未見有關百草枯中毒過程中肺成纖維細胞生物力學特性變化的報道。

5、,前期工作,課題組在這方面已有一定的工作基礎。部分工作人員，曾在吉林省科技發(fā)展計劃項目（20100138）百草枯致中毒性肺纖維化發(fā)病機理的力學生物學研究的支持下，研究了百草枯致中毒后短時間內肺成纖維細胞的 CTGF 的表達、細胞增殖情況及細胞粘彈性的變化等，實驗結果表明百草枯影響了細胞的生物學特性和生物力學特性。并已發(fā)表文章2篇。 1. Guohui Wang，Yongpeng Xie，Dan Shi，Nan Zhang. T

6、he Effects ofmechanical stimulation on proliferation and CTGF expression of human lung fibroblast. The 4th International Conference on Image and Signal Processing, (2011年10月發(fā)表，EI收錄) 2. Guohui Wang，Yongpeng Xie，Nan Z

7、hang. The Study of CTGF Expression of Lung Fibroblasts After Treated by Paraquat，第十六屆亞太呼吸年會.( 2011年11月發(fā)表，SCI收錄),人胚肺成纖維細胞MRC-5,Olympus倒置相差顯微鏡:培養(yǎng)皿中細胞正常生長，形態(tài)呈長梭形。,百草枯處理前后MRC-5細胞顯微圖片,A：正常MRC-5細胞,B：50mg/LPQ培養(yǎng)液處理后,C：100mg/LPQ培

8、養(yǎng)液處理后,D：200mg/LPQ培養(yǎng)液處理后,PQ對MRC-5 CTGF表達的影響,各組細胞CTGF濃度比較（*P<0.05）,PQ對MRC-5生物力學特性影響,肺成纖維細胞在30mm水柱負壓下吸入長度隨時間變化情況,PQ對MRC-5生物力學特性影響,經過PQ處理后MRC-5細胞的粘彈性各項參數(shù)均明顯小于正常MRC-5細胞 也就是說經過PQ處理后的MRC-5生物力學特性降低，變得較“軟” 在經過100mg/L和200mg

9、/L百草枯處理后MRC-5粘彈性要小于50mg/L而100mg/L和200mg/L百草枯處理組之間細胞的粘彈性無明顯差異,各組細胞粘彈性參數(shù)比較,實驗目的,通過實驗研究烏司他丁對百草枯中毒后損傷肺成纖維細胞的修復作用，得到烏司他汀對百草枯致肺損傷的治療效果及治療原理。,實驗內容,應用烏司他汀注射液處理經不同濃度百草枯損傷的肺成纖維細胞，檢測細胞CTGF的表達及細胞的粘彈性，說明烏司他汀對百草枯中毒后損傷肺成纖維細胞的修復

10、作用，研究烏司他汀對百草枯致肺損傷的治療效果并解釋其治療原理。,試驗器材,儀器及材料 細胞：人胚肺成纖維細胞MRC-5，中科院細胞庫。試劑：胎牛血清培養(yǎng)基、胰蛋白酶、CTGF ELISA 試劑盒。主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱、 高低速離心機、微管吸吮系統(tǒng) 、流式細胞儀、ELx-800 NB酶標儀及配套洗板機等。,微管吸吮系統(tǒng),本實驗我們采用微管吸吮技術檢測肺成纖維細胞在一定負壓下吸入長度隨時間的變化，結合標準線性固體粘彈性模

11、型得到了正常及百草枯處理后肺成纖維細胞的生物力學特性（粘彈性參數(shù)），研究百草枯對人肺成纖維細胞生物力學特性的影響。,,試驗方法,1.用含不同濃度百草枯的細胞培養(yǎng)液（50mg/L、100mg/L、200mg/L）處理常規(guī)培養(yǎng)的肺成纖維細胞12h。12h后換含烏司他丁的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在烏司他丁處理后0h、12h、24h、36h、48h獲取細胞進行檢測。2.通過PCR技術及酶聯(lián)免疫吸附試驗技術檢測肺成纖維細胞CTGF的表達。3.

12、結合標準線性黏彈性模型，采用微管吸吮技術測試細胞的力學特性（粘彈性參數(shù)）,,技術流程圖,,,擬解決的技術難題,擬采集數(shù)據(jù)結果,,,UT對PQ處理后MRC-5增殖的影響,UT對PQ處理后MRC-5 CTGF表達的影響,,UT對PQ處理后MRC-5生物力學特性影響,創(chuàng)新點,a.從細胞層次來研究烏司他汀治療百草枯致肺損傷的效果及治療原理。b.根據(jù)細胞CTGF的表達及細胞粘彈性的變化來說明細胞的損傷及修復情況。c.從力學-生物學角度來說