TSC1-TSC2復(fù)合物失活抑制AKT的機(jī)制及其功能研究.pdf

1、目的：結(jié)節(jié)性硬化癥（TSC）是由兩種抑癌基因TSC1或TSC2的功能性失活突變導(dǎo)致哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶點(diǎn)復(fù)合物1（mTORC1）的活化所引起。而且TSC1/TSC2復(fù)合物失活導(dǎo)致的 mTORC1過(guò)度活化能夠負(fù)反饋抑制 AKT，這被認(rèn)為是TSC多為良性腫瘤的主要原因之一。然而，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)的確切機(jī)制我們?nèi)匀徊皇呛芮宄?，而我們的研究目的則是進(jìn)一步闡明這種機(jī)制。
　　方法：在前期的研究工作中，我們通過(guò)基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照小鼠胚胎成纖

2、維細(xì)胞（Tsc2+/+MEFs）相比，Tsc2缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Tsc2-/-MEFs）中血小板源性生長(zhǎng)因子受體α（PDGFRɑ）的表達(dá)明顯下調(diào)。蛋白印記（WB）和實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)一步證實(shí)。并且雷帕霉素（rapamycin）處理或siRaptor干擾能夠恢復(fù)Tsc2-/-MEFs中的PDGFRα的表達(dá)。接著我們構(gòu)建PDGFRα過(guò)表達(dá)的Tsc2-/-MEFs或Tsc1-/-MEFs以及PDGFRα敲低的Tsc2+

3、/+MEFs或Tsc1+/+MEFs，CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖和克隆形成能力。將PDGFRα過(guò)表達(dá)的Tsc2-/-MEFs及其對(duì)照細(xì)胞分別皮下注射到裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)形成腫瘤，接著監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。腫瘤組織進(jìn)行HE和免疫組織化學(xué)染色分析。構(gòu)建的過(guò)表達(dá)或敲低PDGFRα的細(xì)胞系進(jìn)行饑餓加血清或PDGF處理，WB檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。收集Tsc2+/+or Tsc1+/+MEFs、Tsc2-/-or Tsc1-/-MEFs以及雷帕霉素處理的

4、Tsc2-/-or Tsc1-/- MEFs進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)，并對(duì)Tsc2+/+ MEFs、Tsc2-/- MEFs以及雷帕霉素處理的Tsc2-/-MEFs進(jìn)行核質(zhì)蛋白分離分析和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Tsc2缺失以及雷帕霉素處理后FOXO3a表達(dá)變化。建立FOXO3a過(guò)表達(dá)的Tsc2-/- MEFs或Tsc1-/- MEFs和用siFOXO3a干擾敲低FOXO3a表達(dá)的Tsc2+/+ MEFs或Tsc1+/+MEFs，WB和qRT-PCR驗(yàn)

5、證并檢測(cè)PDGFRα，p-AKT的表達(dá)。在線預(yù)測(cè)小鼠PDGFRα基因上的FOXO3a結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分析相對(duì)熒光素酶活性。雷帕霉素和AG1295（PDGFRα抑制劑）聯(lián)合處理Tsc2-/-MEFs或Tsc1-/-MEFs后檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。NTC/T2缺失細(xì)胞皮下注射到裸鼠靠近腋窩的位置來(lái)評(píng)估體內(nèi)聯(lián)合使用雷帕霉素和AG1295的效果，監(jiān)測(cè)腫瘤體積，重量以及小鼠體重。
　　結(jié)果：在這里我們展示了T

6、sc1或Tsc2的缺失下調(diào)PDGFRα的表達(dá)是由活化的mTORC1介導(dǎo)的。另外，我們還證明了PDGFRα的異位表達(dá)促進(jìn)了AKT的活化，增強(qiáng)了TSC1或TSC2功能性缺失的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的增殖和成瘤能力，反之亦然。此外，我們發(fā)現(xiàn)mTORC1是FOXO3a的負(fù)調(diào)控因子，并且活化的mTORC1是通過(guò)FOXO3a介導(dǎo)的PDGFRα基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)抑制PDGFRα的表達(dá)。有趣的是，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)和體外聯(lián)合使用雷帕霉素與AG1295都能明

7、顯抑制TSC1/TSC2復(fù)合物缺陷細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　結(jié)論：因此，我們得出TSC1/TSC2-mTORC1信號(hào)通路通過(guò)抑制FOXO3a負(fù)調(diào)控PDGFRɑ的表達(dá)，PDGFRɑ的表達(dá)下調(diào)抑制了AKT激活和限制了TSC腫瘤的發(fā)生發(fā)展。表明FOXO3a/PDGFRα/AKT信號(hào)通路在抵抗TSC1/TSC2復(fù)合物缺失引起mTORC1的過(guò)度活化從而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中起保護(hù)作用。并且聯(lián)合使用雷帕霉素和AG1295可能是TSC治療的一個(gè)新的有效的策略。