臨床微生物實驗室必須規(guī)范化增

1、臨床微生物實驗室必須進行規(guī)范化操作,吳茂紅江西省臨床檢驗中心,,,人類面臨著微生物的挑戰(zhàn), 要打贏這場戰(zhàn)爭不僅需要有經(jīng)驗的醫(yī)生,還需要一支優(yōu)秀的偵察隊伍—臨床微生物檢驗隊伍。臨床細菌室規(guī)模和發(fā)展速度與10年或20年前相比已經(jīng)發(fā)生了巨大的變化,但離CLSI(臨床實驗室標準化研究所)標準化文件要求還相差很遠,基層細菌室必須進行規(guī)范操作革命才可能應(yīng)對微生物向人類的挑戰(zhàn),才能適應(yīng)臨床的需要。,標本采集

2、 標本運送 標本分離 細菌鑒定和藥敏 報 告,,,,,,反 饋,,全程質(zhì)量控制,參考CLSI 文件從以下7方面提出建議,標本采集和運送的基本規(guī)范；培養(yǎng)前標本質(zhì)量檢測基本規(guī)范；標本分離的基本規(guī)范；細菌鑒定基本規(guī)范；細菌藥物敏感試驗基

3、本規(guī)范；實驗室質(zhì)量保證基本規(guī)范；細菌報告基本規(guī)范；,一.標本采集和運送,標本采集和運送是細菌培養(yǎng)成功的最最重要的關(guān)鍵!但由于標本的采集和運送常有護士或醫(yī)生或病人自己完成,所以也是最不容易做好的事情，而且不知道問題所在之處,檢驗人員不能直接控制其質(zhì)量 造成的后果是:臨床醫(yī)生最不能接受的問題:陽性率低、標本污染,竹（木）簽棉拭子因棉花含有的脂肪酸及竹或木簽含有樹脂和甲醛等對細菌生長的抑制作用而不適于細菌學(xué)標本的采集，建議使用塑

4、料桿的藻酸鹽或滌綸拭子。,棉花纖維 + 竹 /木條,抑 菌 區(qū) 是 因 為 ： 植 物 分 泌 出 來 的 ： 脂 肪 酸 ； 樹 脂 ； 福 爾 馬 林,氯氣 ， 重金屬與膠水的影響,,美國與歐洲對實驗室的新要求,NCCLS M40 標 準 DIN 58942 標 準,推薦COPAN Amies運送培養(yǎng)基,多用途運送系統(tǒng) – 需氧 + 厭氧 低 氧 化 的 環(huán) 境 –不會對標本的微生物造成損害 拭 子 是 深 入 培

5、養(yǎng) 基 中 來 保 護 苛 養(yǎng) 菌 與 厭 氧 菌 兩面是以塑料密封,不透水和漏氣 – 減少污染和維持缺氧環(huán)境,ASM 2004,流感嗜血桿菌在三種不同的運送基的存活率,1.痰標本的采集和運送,1. 標本采集時間：用抗生素前2. 采集方法：自然咳痰：必須用請水漱口3次，應(yīng)包括咽喉部，立即用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培養(yǎng)基中。支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫(yī)生采集，建議直接種入輸送培養(yǎng)基,2.泌尿標本 采集與運送,1．采集后的標本應(yīng)

6、立即送檢。2．采集時間：多數(shù)藥物從尿道排泄，所以不管用哪種方法都應(yīng)在用藥前采集。應(yīng)采集早晨第一次的尿。3. 標本管不應(yīng)含防腐劑和消毒劑。尿標本保存：室溫下保存時間不得超過2h（夏季保存時間應(yīng)適當縮短或冷藏保存）4℃冷藏保存標本時間不得超過8h，但應(yīng)注意冷藏保存的標本不能用于淋病奈瑟菌培養(yǎng)。,泌尿標本,4.采集中段尿時要先用肥皂清洗女性的外陰和男性的外生殖器包括包皮內(nèi)，然后用清水沖洗。5.長期留置導(dǎo)尿管的患者應(yīng)在更換新管時留取尿

7、標本。6. 做厭氧培養(yǎng)時應(yīng)膀胱穿刺采集尿。,3.分泌物,1. 對開放性病灶的采集：如眼結(jié)膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術(shù)后切口、導(dǎo)管治療感染、瘺管內(nèi)膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應(yīng)先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。2. 閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應(yīng)在用藥前采集，應(yīng)注意膿液的

8、氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時送檢應(yīng)應(yīng)用輸送培養(yǎng)基。,4.便標本,1.采集時間：腹瀉患者應(yīng)在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應(yīng)在2周內(nèi)采；厭氧菌出現(xiàn)癥狀即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的容器內(nèi)或直接盛于增菌液或保存液中；對不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存液或輸送培養(yǎng)基中送檢。,便標本,注意事項：⑴雖然糞便

9、標本本身含很多細菌但也要用無菌容器。⑵在患者病情許可的條件下應(yīng)在用藥前采集標本。⑶應(yīng)床邊接種或置輸送培養(yǎng)基送檢。⑷厭氧細菌（難辯梭菌）培養(yǎng)的標本應(yīng)盡量減少與空氣接觸。,5.厭培養(yǎng)標本,1.痰標本的厭氧培養(yǎng)標本采集：必須用氣管穿刺法獲得痰液，從口腔吐出的痰標本不能用于厭氧培養(yǎng)。2.尿標本的厭氧培養(yǎng)標本采集：恥骨上膀胱穿刺獲得尿標本可用于厭氧菌培養(yǎng) 3．便標本厭氧培養(yǎng)標本采集： 可用排出的便做厭氧培養(yǎng)但也應(yīng)少與空氣接觸。,環(huán)甲

10、膜穿刺,6.血液及骨髓標本,1. 采血時間：盡可能在用抗生素前，心內(nèi)膜炎例外。2. 采血量：采一次或采一瓶是錯誤的，至少應(yīng)采一套2瓶，分需氧和厭氧。2瓶血量不少于16-20ml，先將10ml注入需氧瓶，再將剩余血采血注入?yún)捬跗俊?. 采血方法：不要與血氣和血沉標本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導(dǎo)管或靜脈留置口采血。,為什么強調(diào)血培養(yǎng)抽2~3套？,有研究表明： 單次一套血培養(yǎng)的陽

11、性率為65% 雙次兩套血培養(yǎng)的陽性率為80% 三次三套血培養(yǎng)的陽性率為96%,血液及骨髓標本,4. 采血間隔：如第一次采集2套（4瓶）血培養(yǎng)標本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內(nèi)膜炎和導(dǎo)管相關(guān)性敗血癥。5.  兒童：采血量是總血量的1%。6. 延遲培養(yǎng)瓶處理: 延遲培養(yǎng)瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細菌室。7. 皮膚消毒液推薦：建議先用70-80%異丙醇

12、去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。,抽血量和體重的關(guān)系,二.標本培養(yǎng)前的基本規(guī)范,1.痰培養(yǎng)標本實驗室在接種前必須作痰涂片革蘭染色，當在低倍鏡下白細胞小于10個每視野、上皮細胞大于25個每視野時應(yīng)作為不宜做培養(yǎng)的標本；當白細胞小于10個每視野，上皮細胞小于25個每視野時再參照油鏡觀察標本中細菌分布作出判斷。,痰培養(yǎng)標本,當標本中細菌種類超過3種以上，未見到釬毛拄狀上皮細胞，作為不合格標本；如見到數(shù)量不等的白血胞或釬毛拄狀上皮細胞或兩者同

13、在，含1-2種不同細菌，可考慮繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果可根據(jù)病情再作分析；當涂片中見到1-3種細菌，少量的扁平上皮細胞，少量或較多纖毛拄狀上皮細胞均可按合格標本繼續(xù)培養(yǎng)。,不合格的痰涂片,合格的痰涂片,2.厭氧培養(yǎng),在正常上班時間：申請厭氧培養(yǎng)的科室應(yīng)邀請實驗室，由臨床醫(yī)生或護士協(xié)作采集，細菌室行床邊接種。自然排出的尿標本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰標本均為不合格的厭氧培養(yǎng)的標本，應(yīng)于退檢。沒有條件或不能及時送檢的情況下均應(yīng)用輸送培

14、養(yǎng)基放置標本 。,3.培養(yǎng)前應(yīng)有涂片結(jié)果結(jié)合涂片推斷定植菌或致病菌,⑴尿培養(yǎng)分離出3種以上的細菌，或分離出凝固酶陰性葡萄球菌、革蘭陽性棒狀桿菌等非定義為致病菌的細菌，涂片未見到，應(yīng)在報告中提示可能是污染細菌建議結(jié)合臨床表現(xiàn)考慮結(jié)果的參考價值。⑵眼結(jié)膜拭子分離出凝固酶陰性葡萄球菌，涂片未見到，可能是污染細菌，應(yīng)建議重送標本。,培養(yǎng)結(jié)果結(jié)合涂片判斷定植菌或致病菌,⑶前列腺液標本分離出凝固酶陰性葡萄球菌或革蘭陽性小桿菌，涂片未見到，可能

15、是污染細菌，應(yīng)建議重送標本。⑷當涂片中見到的細菌，并有細菌吞嗜現(xiàn)象存在，在培養(yǎng)時分離出該細菌可推測為致病菌。,培養(yǎng)結(jié)果結(jié)合涂片判斷定植菌或致病菌,（5）涂片報告的日期和培養(yǎng)報告日期要對應(yīng)便于醫(yī)生判別結(jié)果的參考價值.（6）并每一視野可見到>20個/油鏡或該菌占所見到細菌的50%,可推測是標本中的優(yōu)勢細菌.,,有了合格的標本是保證培養(yǎng)成功的重要條件，但如果沒有適宜的分離培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境同樣不能獲得好的結(jié)果，為此制定如下基本條例以

16、保證致病細菌分離成功。,三.分離培養(yǎng)基本規(guī)范,1.痰培養(yǎng),1.培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭瓊脂或伊紅美蘭、或加MRSA顯色瓊脂。2．培養(yǎng)環(huán)境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35℃環(huán)境培養(yǎng)，其他培養(yǎng)基置35℃空氣培養(yǎng)。3．結(jié)核培養(yǎng)：羅氏雞蛋斜面，每一標本種2支，37℃空氣培養(yǎng)。,2.尿標本,1．培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭，或CP3尿致病菌分離顯色瓊脂。2.菌落計數(shù)：每個標本都要做

17、，用加樣器或定量接種環(huán)取樣本20ul分別接種于上述培養(yǎng)基均勻涂布整個平皿，此日作菌落計數(shù)。3．培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng),3.便培養(yǎng),1．培養(yǎng)基：中國蘭或伊紅美蘭，沙門氏志賀氏瓊脂（SS瓊脂）或加沙門菌分離瓊脂。2．培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。3．疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面、梭狀芽孢桿菌分離瓊脂（CCFA）。5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面置35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。CCFA置35℃厭氧環(huán)境培養(yǎng)。其他特殊腸道致病菌培

18、養(yǎng)按國家CDC要求執(zhí)行。,4.腦脊液培養(yǎng),1．培養(yǎng)基：5%兔血巧克力瓊脂、5%羊血瓊脂。 2．培養(yǎng)環(huán)境：35℃，5-10%CO2環(huán)境培養(yǎng)。,5.分泌物培養(yǎng),1．培養(yǎng)基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯。2．培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。,6.膽汁或胸水或腹水,1．培養(yǎng)基：如標本量大時可按血液培養(yǎng)方法直接取16-20ml分別種入需氧和厭氧培養(yǎng)瓶。如標本量有限，可接種5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中

19、國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯。2．培養(yǎng)環(huán)境：35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)。,四.細菌鑒定規(guī)范操作,1. 涂片染色一．涂片染色：應(yīng)具備最基本的兩種染色技術(shù)，即革蘭氏染色和抗酸染色。1. 革蘭染色：革蘭染色報告必須包括染色反應(yīng)或微生物種類和類別，描述物種的形態(tài)或結(jié)構(gòu)。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。偽膜性腸炎見革蘭陽性粗大桿菌，芽胞呈卵圓形，位于菌體近極端。,竹節(jié)狀菌絲,WBC吞噬革蘭氏陽性球菌,涂

20、片染色,2.抗酸染色：抗酸染色報告應(yīng)顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌三種結(jié)果，報告中應(yīng)以加號體現(xiàn)標本中抗酸桿菌的存在量。如找到抗酸桿菌++；見到染色不典型抗酸桿菌+，建議再送標本。不能報告找到結(jié)核桿菌但可報告未找到結(jié)核桿菌,2. 趨向性鑒定試驗,革蘭陽性球菌:觸酶試驗:3%H2O2用30%的H2O2稀釋10倍后使用，避光4度保存 ；試驗時設(shè)立陽性和陰性對照；1分鐘內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡為陽性。凝固酶試驗：采用商品試劑或EDTA抗凝的多個兔混

21、合血漿；測定玻片法測定凝聚因子10秒鐘即可觀察結(jié)果；測定凝固酶需在37度3-4h，若陰性還應(yīng)放置24h再觀察結(jié)果。,革蘭陰性桿菌:氧化酶試驗,建議用紙片法保存比較方便；試劑配制：1%鹽酸四甲基對苯二胺水溶液陽性：由粉紅變?yōu)樗{紫色為陽性對照：銅綠假單孢菌 ATCC 27853 + 大腸埃希菌 ATCC25922 -,3.血清學(xué)試驗,腸道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學(xué)的試驗作最后確認，基層細菌

22、室應(yīng)具備1-3項血清試劑。,血清學(xué)鑒定,1.志賀氏菌多價和單價凝集血清：2.沙門氏菌多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結(jié)血清4. 耶爾森氏菌凝集血清,4.真菌鑒定,1．每一基層實驗室必須開展真菌涂片，報告臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態(tài)辨別常見絲狀真菌;區(qū)別曲菌或毛霉菌。2．開展酵母樣真菌分離培養(yǎng)，應(yīng)具備最基本的沙保弱培養(yǎng)基或用顯色培養(yǎng)基，鑒別白念和非白念，隱球菌等。3.有條件的實驗室應(yīng)開展非培養(yǎng)的鑒定

23、方法，如?-D葡聚糖的檢測。,念珠菌顯色培養(yǎng)基CHROMagar Candida,真菌概述,真菌的基本結(jié)構(gòu)：菌絲和孢子菌絲：有隔、無隔，形態(tài),,鹿角狀菌絲,真菌絲,病原真菌鑒定的基本流程,臨床標本,,PDA, SDA28度培養(yǎng),,,,,,不能生長,鼻孢子菌、肺孢子菌、馬拉色菌（厚皮除外）,,,,,,芽孢,關(guān)節(jié)孢子,念珠菌、隱球菌、紅酵母等,毛孢子菌、地霉等,,,,,有隔菌絲,無隔菌絲,擔子菌、子囊菌、半知菌,接合菌等,區(qū)分酵母樣或

24、霉樣菌落,,厚膜孢子,關(guān)節(jié)孢子及菌絲,芽生孢子,五.藥敏試驗的規(guī)范操作,1. 用CLS指南推薦的K—B藥敏標準進行常規(guī)藥敏試驗判斷。2.根據(jù)CLSI更新及時替換應(yīng)用的標準。3.根據(jù)CLSI推薦的方法，開展重要耐藥菌的檢測，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。,,－紙片擴散法,AST,操作步驟 制備接種物（0.5麥氏單位）

25、 接種（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻） 在接種好的瓊脂平板上貼加紙片 孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35°C空氣孵育）

26、 苛養(yǎng)菌5％CO2孵育 判度結(jié)果和解釋結(jié)果,,,,,AST－紙片擴散法,判讀結(jié)果 將游標卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應(yīng)距離一個黑色不反光的背景數(shù)英寸，并用反射光照明。 如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測量抑菌圈。 如果被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應(yīng)孵育24小時，再在透射光下

27、分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。,ESBL初步篩選實驗,必須進行ESBL篩查和確認的細菌有大腸埃希菌、肺炎克雷伯、產(chǎn)酸克雷伯 和臨床有關(guān)的奇異變形桿菌！,ESBL確認試驗,ESBL的質(zhì)控頻率,篩選試驗和表型確證試驗均可每日進行或每周進行，所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。 應(yīng)該注意的是：肺克700603ESBL基因在質(zhì)粒上，應(yīng)將其凍存于-60℃或以下。,奇異變形桿菌

28、 ESBL 監(jiān)測試驗,*P. mirabilis 不同于其他菌 (比如 ≤17 mm and >4 µg/ml for E. coli and Klebsiella spp.); NA, 不適用,CLSI M100-S16; Table 2A (M2, M7),NEW,可誘導(dǎo)的克林霉素耐藥 (erm-介導(dǎo))常規(guī)D－試驗: 陽性 15 ?g 紅霉素紙片及 2 ?g克林霉素之間距離為15-26.,“D

29、 Test” –陽性反應(yīng),,,2006強調(diào),mecA介導(dǎo)的葡萄球菌耐藥的表型試驗,紙片擴散法 – 用頭孢西丁 (CX DD 30 ?g) 紙片金葡菌 –其結(jié)果等于苯唑西林紙片(OX DD)結(jié)果。CoNS – 結(jié)果優(yōu)于苯唑西林紙片的結(jié)果。結(jié)果清晰，讀起來比苯唑西林容易。報告時仍寫苯唑西林，而不寫頭孢西丁。MIC試驗 – 仍用苯唑西林藥。,常見耐藥菌釋意,產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶菌株（ESBLs）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）,耐甲

30、氧西林葡萄球菌（MRS）,MRS包括凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。 表示其對β-內(nèi)酰胺類藥物，如青霉素類、β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合物、頭孢類、碳青霉烯類，可在體外顯示活性但臨床上無效。,如果為產(chǎn)酶株，不管體外藥敏如何，其對青霉素類、頭孢菌素類、氨曲南耐藥！臨床上不能使用這些藥物。,產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶菌株（ESBLs）,CLSI 在表格的導(dǎo)言中對ESBL增加了警告 “Warning” 條文,N

31、EW,六.質(zhì)量控制的規(guī)范化,1．藥物敏感試驗的質(zhì)量控制：應(yīng)包括30天的初始質(zhì)量穩(wěn)定測試；每周一次的常規(guī)質(zhì)量控制；5天的糾控程序。2．鑒定試劑質(zhì)量控制：購入新的試劑；在更換批號；更換生產(chǎn)廠家；結(jié)果發(fā)生異常等情況時均應(yīng)進行質(zhì)量控制。3．染色液質(zhì)量控制：每天臨床標本染色前應(yīng)包括染色結(jié)果陽性和陰性的對照物及染色液污染的質(zhì)量檢查。,質(zhì)量控制內(nèi)容,4．分離培養(yǎng)基：如血瓊脂和巧克力，用肺炎鏈球菌、β-溶血和草綠色溶血的鏈球菌、流感嗜血桿菌、等苛養(yǎng)

32、細菌的標準菌株或經(jīng)標準化試劑已證實結(jié)果正確的菌株進行測試，判斷其分離能力。5.培養(yǎng)箱溫度的質(zhì)量控制：每天第一個開箱和最后離開實驗室均應(yīng)對培養(yǎng)箱的溫度作記錄；CO2培養(yǎng)箱還應(yīng)記錄CO2的含量。,質(zhì)量控制內(nèi)容,6．冰箱溫度記錄：按每一冰箱存放的物品不同設(shè)置不同的質(zhì)控范圍，特別對低溫冰箱；每天記錄一次。7．自動化設(shè)備：按廠家提供的SOP文件進行質(zhì)控；在設(shè)備軟件升級或修改版本時均應(yīng)進行質(zhì)量控制程序。8. 每一有權(quán)向臨床發(fā)報告的實驗室都應(yīng)

33、參加全國或省或市級質(zhì)量控制活動。,,細菌實驗室應(yīng)對不同的細菌檢驗報告時間和內(nèi)容應(yīng)有相應(yīng)的規(guī)定，并告訴臨床各科，依此可防止不明原因的報告延遲應(yīng)分兩種報告形式：1.危重感染報告:2.常規(guī)報告:,七.臨床細菌室報告制度的規(guī)范,1.涂片報告,1.革蘭染色：危重報告30－６０分鐘報告。報告內(nèi)容應(yīng)包括染色反應(yīng)、是細菌或真菌、細菌形態(tài)。有無細胞內(nèi)吞嗜現(xiàn)象，有無菌絲。2.抗酸染色：報告抗酸染色陽性或陰性；菌量以加號表示。常規(guī)報告24h,危重報告

34、1h－2ｈ。,2.血液和無菌體液培養(yǎng)的報告制度,細菌檢驗報告應(yīng)實行三級報告制度！第一級：培養(yǎng)液直接涂片結(jié)果；第二級：初步藥敏結(jié)果和平皿菌落涂片結(jié)果；第三級：正式細菌鑒定和藥敏報告。,3.便培養(yǎng),24小時可發(fā)出初始報告;72小時應(yīng)報告藥敏試驗結(jié)果；根據(jù)檢測范圍報告檢測結(jié)果，如未檢測出沙門菌、志賀菌。 錯誤報告: 未見到致病菌,4.尿培養(yǎng),可在24小時報告初始結(jié)果，包括菌落計數(shù)和可能細菌種類，如氧化酶陰性的革蘭陰性桿菌；金黃色