臨床微生物實驗室質(zhì)量控制及質(zhì)量保證

1、,衛(wèi)生部臨床檢驗中心胡繼紅,臨床微生物實驗室質(zhì)量控制及質(zhì)量保證,質(zhì)量控制概念的引入,歷史上，現(xiàn)代風(fēng)險管理的概念引入實驗室之后，就以質(zhì)量控制的形式出現(xiàn)。狹義上指的是一項持續(xù)的、系統(tǒng)性的評估工作來確保終產(chǎn)品的一致性—— 根據(jù)可接受的程度：事先建立好的允許限度下的精確度和準(zhǔn)確度。,臨床微生物實驗室質(zhì)量控制環(huán)節(jié),分析前,,,分析前,分析中,分析后,《臨床機構(gòu)實驗室管理辦法》基本要求,《實驗室管理辦法》微生物室內(nèi)質(zhì)量控制基本要

2、求,一、培養(yǎng)基,,實驗室使用的所有培養(yǎng)基使用前應(yīng)做無菌試驗，并按培養(yǎng)基的用途做生長試驗，或選擇性生長試驗，或耐藥篩選試驗等。,,無菌試驗：排除培養(yǎng)基生產(chǎn)、運輸和貯存過程的污染可能。,生長試驗：檢驗培養(yǎng)基標(biāo)本中可能存在的目標(biāo)菌能否生長—— 分離培養(yǎng)的關(guān)鍵！,,解釋：培養(yǎng)基在使用前隨機挑選，培養(yǎng)1天，觀察是否污染。 非選擇培養(yǎng)基（血平板、巧克力平板） 選

3、擇培養(yǎng)基（淋球菌培養(yǎng)基、麥康凱平板等） 單管生化培養(yǎng)基、微量管生化培養(yǎng)基、 苯唑西林耐藥篩選平板等 無菌生長為合格。,培養(yǎng)基生長試驗,自制培養(yǎng)基：每批做質(zhì)控用菌株根據(jù)期望結(jié)果選擇 確認要求生長特性（溶血、特征菌落等） 選擇性（生長/不生長，淋球菌選擇培養(yǎng)基） 加強營養(yǎng)（苛養(yǎng)菌、巧克力瓊脂） 鑒定用生化反應(yīng)（陰性、陽性，如：氧化/發(fā)酵，

4、動力等）,質(zhì)控菌株的貯存 日常用： 4-8 ℃,胰酶消化大豆肉湯（非苛養(yǎng)菌）；高營養(yǎng) 巧克力瓊脂斜面（苛養(yǎng)菌），每周轉(zhuǎn)種。 中期貯存：50％胎牛血清肉湯，脫纖維羊血或脫脂牛奶， 10-15％甘油胰酶消化大豆肉湯，-20℃。 長期貯存：凍干或液氮。,,,二、主要試劑（至少）,每個工作日或每次試驗應(yīng)做質(zhì)控（陽性對照及陰性對照）,過氧化氫酶：

5、區(qū)別鏈球菌屬/葡萄球菌屬，少見G-菌、G+菌凝固酶: 區(qū)別金黃色葡萄球菌/凝固酶陰性葡萄球菌，藥敏標(biāo)準(zhǔn) 致病性和用藥等都不同氧化酶： G-菌區(qū)別，腸桿菌科/非發(fā)酵菌/弧菌科/少見G-菌等?β-內(nèi)酰胺酶：預(yù)測流感嗜血桿菌、卡他布蘭漢菌和淋病奈瑟 菌對青霉素類抗生素敏感性；葡萄球菌屬對青 霉素敏感性。,

6、臨床意義,過氧化氫酶，凝固酶，氧化酶是臨床常見菌鑒定非常重要的三個基本試驗， 也是決定鑒定方向的重要指標(biāo); β-內(nèi)酰胺酶在判斷苛養(yǎng)菌流感嗜血桿菌、卡他布蘭漢菌和淋病奈瑟菌對青霉素、阿莫西林和氨芐西林的敏感性。,應(yīng)每個工作日做質(zhì)控，或在檢測菌株時用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照和陽性對照做質(zhì)控。,具體要求,過氧化氫酶（H2O2）,區(qū)別鏈球菌屬/葡萄球菌屬，少見G-菌、G+菌,陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC 25923陰性對照

7、：糞腸球菌ATCC12228,血漿凝固酶試驗玻片法：凝集因子 /試管法：凝固酶,陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC 25923陰性對照：表皮葡萄球菌ATCC12228,區(qū)別金黃色葡萄球菌/凝固酶陰性葡萄球菌藥敏標(biāo)準(zhǔn)、致病性和用藥等都不同,氧化酶/β內(nèi)酰胺酶,氧化酶試驗陽性對照：綠膿假單胞菌ATCC27853陰性對照：大腸桿菌ATCC25922,β內(nèi)酰胺酶試驗陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC25923陰性對照：流感嗜血桿

8、菌ATCC29247,其他常用基本試驗,OP： 肺炎鏈球菌S/其他草綠色鏈球菌R桿菌肽：化膿鏈球菌S/其他β-溶血鏈球菌R,CAMP：無乳鏈球菌（+） 其他β-溶血鏈球菌（-）,流感嗜血桿菌：X、V分別都不生長，X+V因子：生長其他嗜血桿菌屬：X生長或V生長,三、自制生化鑒定試劑,舉例：實驗室自制的常規(guī)生化鑒定大管或微量管培養(yǎng)基 （鏈球菌、葡萄球菌、腸桿菌科和弧菌科/非發(fā)酵菌等）,每批試劑使用前應(yīng)使用

9、相應(yīng)陰性和陽性反應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)）菌株做質(zhì)控；合格后，注明批號，在一定時間內(nèi)使用。,,具體要求,,,尿素、氨基酸,吲哚,四、染色液,革蘭染色：使用大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進行質(zhì)控；抗酸染色：使用已知抗酸陽性菌株（或標(biāo)本）進行質(zhì)控； 每批試劑至少1次,最好定期做質(zhì)控。當(dāng)染色結(jié)果不確定時，可做質(zhì)控作為對照。,革蘭染色：G+: 金黃色葡萄球菌ATCC2592

10、3G-: 大腸埃希菌ATCC25922,抗酸染色：陽性：Mube.trculosisATCC25177陰性：大腸埃希菌ATCC25922,,肺炎鏈球菌,大腸埃希菌,G+,G-,,,電 鏡,G染色,抗酸染色陽性,,,五、細菌、酵母菌鑒定系統(tǒng),使用廠家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株對相應(yīng)試劑進行質(zhì)控每批試劑至少1次,手工、半自動系統(tǒng)、自動系統(tǒng)：使用廠家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株做質(zhì)控，應(yīng)符合預(yù)期結(jié)果；質(zhì)控頻率：每批試劑使用前需要先做質(zhì)控當(dāng)使用新

11、系統(tǒng)或新的操作人員以考察技術(shù)人員操作是否滿足廠家操作說明書要求,,,,可增加質(zhì)控次數(shù),不同系統(tǒng)鑒定試劑分類不同,G＋菌：葡萄球菌屬鏈球菌屬棒狀桿菌屬其他,G－菌：腸桿菌科非發(fā)酵菌苛養(yǎng)菌少見菌,酵母樣真菌：,,六、藥物敏感試驗（手工法）,紙片擴散法：每周至少1次；更換藥物或培養(yǎng)基時要做質(zhì)控。常見菌：大腸埃希菌ATCC25922, 金黃色葡萄球菌25923, 綠膿假單胞菌 27853

12、 質(zhì)控,手工法（稀釋法）：每周至少1次，最好每次試驗做質(zhì)控。 解釋：手工法（稀釋法）：常規(guī)試驗通常使用微量肉湯稀釋法， 標(biāo)準(zhǔn)做法是每批試驗標(biāo)準(zhǔn)菌株與臨床分離株同時做。金黃色葡萄球菌29213, 大腸埃希菌ATCC25922綠膿假單胞菌 27853 質(zhì)控,,,,,,抗生素藥敏試驗,紙片法 新批號藥做；一般每周做； 失控時天天做，連續(xù)30天，準(zhǔn)確度和精確 度達到后才恢復(fù)每天做； 一個藥物失控時

13、，重新測5天。稀釋法 瓊脂法、微量肉湯法每次同時做質(zhì)控,藥敏試驗失控措施,對每種藥物、每種菌株，30次試驗總失控結(jié)果不能超過3個。如果30天監(jiān)控結(jié)果完全符合上述要求，可轉(zhuǎn)為一周一次質(zhì)控的方法。只要抑菌環(huán)直徑超出可接收范圍都必須校正當(dāng)失控原因不明時，可用相應(yīng)質(zhì)控菌株連續(xù)監(jiān)測5天；每種菌株對質(zhì)控中每種抗菌藥物同時測試5個抑菌環(huán)，如果結(jié)果全部達到可接收范圍，可恢復(fù)一周一次質(zhì)控。,藥物敏感試驗（儀器法）,使用廠家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株對相應(yīng)

14、試劑進行質(zhì)控 每批試劑至少1次當(dāng)試驗結(jié)果異常、不穩(wěn)定，或缺少經(jīng)驗的人員操作時，應(yīng)增加質(zhì)控的頻率。,,,,以上內(nèi)容只是對臨床微生物實驗室室內(nèi)質(zhì)控的基本要求，只能滿足分析中對主要培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)控需要，是進行相應(yīng)試驗操作的實驗室應(yīng)做到或至少要做到。,質(zhì)量控制是保證臨床微生物實驗室是否能提供準(zhǔn)確、可靠、可重復(fù)和具有臨床意義的檢測信息，依靠評價臨床標(biāo)本的質(zhì)量，監(jiān)控試驗步驟、儀器、培養(yǎng)基、試劑和人員操作，復(fù)核試驗結(jié)果，記錄試驗

15、方法的有效性來實現(xiàn)。 完整的臨床微生物實驗室質(zhì)量控制應(yīng)包含對檢驗過程的分析前、分析中和分析后所有環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制。,質(zhì)量保證概念,在廣義上，微生物的質(zhì)控工作與其說是科學(xué)，不如說是門藝術(shù)。它包含眾多無形的項目，如常識、良好的判斷力、始終如一的細節(jié)關(guān)注。 高水平的實驗室表現(xiàn)需要機智、有興趣的、積極主動的員工參與。強調(diào)的重點，在某種程度上，已經(jīng)從嚴格的實驗室內(nèi)部的點對點質(zhì)控工作轉(zhuǎn)移到更為寬泛的針對病人關(guān)懷的品質(zhì)保證工作

16、。及時的報告可以給內(nèi)科醫(yī)生提供參考，也可以最大限度的指導(dǎo)病人關(guān)懷,質(zhì)量保證持續(xù)監(jiān)測評價和持續(xù)改進檢測病人標(biāo)本結(jié)果的可靠性和有效性,,臨床微生物實驗室質(zhì)量控制范疇,標(biāo)本分析前的質(zhì)量控制：微生物學(xué)特殊性——得到正確分析結(jié)果的基礎(chǔ),大量的分析前因素影響微生物實驗的診斷價值,質(zhì)量控制內(nèi)容：1、合理的標(biāo)本采集 向臨床提供標(biāo)本采集說明(sop) 正確時間部位方法等采集時間；標(biāo)本來源,對收集和運送標(biāo)本的容器控制:

17、無菌無防腐劑 足夠大安全嚴密不易碎運送培養(yǎng)基加強無生長因子或保持特定菌的培養(yǎng)基避免用木質(zhì)的棉試子對細菌有毒害,,,,影響血培養(yǎng)的臨床操作,皮膚及裝置消毒有效性的指標(biāo)： 在靜脈穿刺時或從留置裝置獲得血樣時，血培養(yǎng)陽性——感染而非污染 血培養(yǎng)的污染，特別是凝固酶陰性的葡萄球菌，是最常見導(dǎo)管相關(guān)菌血癥的致病因子也是最常見的血培養(yǎng)污染因子——不但引起醫(yī)生的困惑而且增大花費。 減少污染對于微生物實驗室和

18、健康機構(gòu)來說都是關(guān)鍵問題。,皮膚消毒及預(yù)防污染,皮膚消毒的傳統(tǒng)推薦方法為70%酒精加上聚維酮碘溶液或碘酊。聚維酮碘在接觸1.5-2分鐘后達到最大消毒效果，而碘酊為0.5分鐘。 與內(nèi)置導(dǎo)管相比，靜脈穿刺血樣較少污染。,血樣培養(yǎng)數(shù)量,非自動血液培養(yǎng)系統(tǒng)（采血量為20ml）研究顯示，在成人培養(yǎng)2-3份血樣就能檢測出幾乎所有的（≥99%）血流感染。 研究顯示使用相同采血量，培養(yǎng)3份血樣，接種于單份自動血培養(yǎng)系統(tǒng)，非心內(nèi)膜炎檢出率為9

19、6%。不應(yīng)使用單一瓶血培養(yǎng)，單一培養(yǎng)提供的血量不足，檢不出某些感染。凝固酶陰性葡萄球菌、綠膿桿菌及類白喉菌的生長多數(shù)情況下代表污染，而也可能是重要的臨床感染。在此情況下，解釋陽性結(jié)果就顯得非常困難了。,血培養(yǎng)的時機,針對血培養(yǎng)的時機缺乏系統(tǒng)的研究。盡管菌血癥經(jīng)常出現(xiàn)寒戰(zhàn)，但是在發(fā)熱前，而發(fā)熱時才會把血培養(yǎng)提上日程。有權(quán)威建議血培養(yǎng)應(yīng)被安排在任意間隔。但在一項回顧性調(diào)查中，Li等認為，在24小時內(nèi)或固定間隔獲得血樣的結(jié)果沒有

20、差別。臨床醫(yī)生和實驗者應(yīng)根據(jù)患者的狀態(tài)及懷疑的診斷決定。對于敗血癥或不穩(wěn)定的患者，血培養(yǎng)須迅速，以便制定治療方案。相反地，若在病情穩(wěn)定的患者懷疑是亞急性心內(nèi)膜炎，應(yīng)在固定間隔采集血樣。,2、正確的運送方式(sop) （運送工具和有效時間及儲存方法等）,標(biāo)本因冷藏及pH改變或在氧氣中暴露，可能減少很多種細菌的存活時間 腦膜炎球菌，淋病奈瑟菌， 流感嗜血桿菌，肺炎鏈球菌，

21、 沙門菌，志賀氏菌， 霍亂弧菌，空腸彎曲菌及厭養(yǎng)菌 定量評價細菌數(shù)量的培養(yǎng)（尿標(biāo)本）（運送時間） 對環(huán)境敏感菌株在運送中數(shù)量快速減少時，如果運送時間太長，其它菌則成倍增長，目標(biāo)細菌可同其它菌一起過度生長。 需進行細菌學(xué)檢測的所有標(biāo)本， 應(yīng)在收集后2小時內(nèi)送到實驗室,細菌學(xué)試驗的各種標(biāo)本的運送及貯存條件,3、有可靠的標(biāo)本質(zhì)量評價方法(

22、sop),痰標(biāo)本中>10上皮細胞中，<25個WBC24h尿標(biāo)本或痰標(biāo)本找抗酸桿菌或真菌培養(yǎng)痰試子找抗酸桿菌或真菌評價標(biāo)本量是否足夠標(biāo)本不合格！,4、拒收標(biāo)本指標(biāo),除非不能再采集的標(biāo)本，否則不予檢測； 如果培養(yǎng)或檢測，要對結(jié)果進行說明。書寫錯誤容器問題干燥試子厭養(yǎng)菌容器,無菌無防腐劑足夠大安全嚴密不易碎運送培養(yǎng)基無生長因子或保持特定菌的培養(yǎng)基避免用木質(zhì)的棉試子對細菌有毒害,,分析中質(zhì)量控制

23、：,常規(guī)儀器和設(shè)備成品商業(yè)培養(yǎng)基（診斷抗血清）,定期維護和校準(zhǔn)、記錄,pH計厭氧指示劑水浴葙天平加樣器自動高壓滅菌器生物安全柜,,年檢、驗證,培養(yǎng)時間、溫度控制,葡萄球菌藥敏試驗06年CLSI 35±2℃，16-18h,苯唑西林，甲苯西林，奈夫西林和萬古霉素24h。 35 ℃以上可能檢測不出MRS. 淋球菌藥敏試驗 36±1℃（不能超過37℃）,培養(yǎng)葙、水浴和冰箱可接受溫度范圍

24、,,成品商業(yè)培養(yǎng)基,接收時記錄批號，接收日期； 廠家提供質(zhì)控文件，如實沿用氣體，培養(yǎng)時間長度，可接受的結(jié)果；使用的實驗室必須檢查外觀，破損、污染、溶血或凍壞情況；有效期內(nèi)質(zhì)量是否有變化,必須做質(zhì)控的商業(yè)培養(yǎng)基,做藥敏試驗 MH培養(yǎng)基 巧克力瓊脂 彎曲菌瓊脂 淋球菌選擇培養(yǎng)基用于主要的微生物鑒定 試劑盒中的培養(yǎng)基有兩種或更多的底物有相對高的失敗率廠家不做的羊血瓊脂CAMP細胞培養(yǎng)用,分析后質(zhì)量控制：

25、,1、臨床微生物學(xué)“緊急報告值” 2、監(jiān)測報告結(jié)果是否正確、清楚、及時。,陽性血培養(yǎng)的解釋,在多數(shù)醫(yī)院中，血培養(yǎng)的陽性率在8-14%。在這些陽性標(biāo)本中，有近一半至三分之二是引起菌血癥及真菌血癥的罪魁禍?zhǔn)?，剩余的則為污染或未知臨床意義的。陽性標(biāo)本臨床意義的解釋經(jīng)常伴隨臨床問題。對陽性結(jié)果的誤解通常給患者及醫(yī)院帶來巨大損失。有幾條標(biāo)準(zhǔn)有助于對結(jié)果的解釋，包括辨別微生物自身形態(tài)、多于一份血培養(yǎng)為相同微生物的陽性結(jié)果、在另一無菌培養(yǎng)瓶中

26、發(fā)現(xiàn)相同微生物。,,當(dāng)從血中分離出葡萄球菌、大腸桿菌、腸桿菌科家族、綠膿假單胞菌、肺炎鏈球菌及白色念珠菌時，通常表示感染的存在。當(dāng)分離到棒狀桿菌屬、桿菌屬、丙酸桿菌屬時，表示菌血癥。凝固酶陰性葡萄球菌在解釋臨床意義時通常最容易出問題，因為該菌無所不在，并且12-15%為病原菌而不是污染。陽性培養(yǎng)瓶的數(shù)量并不能作為判斷凝固酶陰性葡萄球菌臨床意義的可信賴標(biāo)準(zhǔn)。陽性培養(yǎng)基數(shù)量是解釋時一項有用的數(shù)據(jù)。若多數(shù)或所有培養(yǎng)基均為同一微生物陽性

27、，則其臨床意義基本可以肯定。盡管做最終決定的是醫(yī)生，但微生物學(xué)家依舊可以對血培養(yǎng)的臨床意義提供重要指導(dǎo)。,注重培養(yǎng)微生物工作人員的質(zhì)量控制意識,有形的、看得見的 ——微生物實驗的質(zhì)量可以通過正確的操作來體現(xiàn)，例如革蘭染色試劑，可以通過對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的染色來反映操作和試劑的質(zhì)量。 質(zhì)量控制更依賴于工作人員的認知能力 一個受過充分培訓(xùn)的、能夠嚴謹?shù)胤治鰧嶒灲Y(jié)果的工作人員，不是只能夠忠實地記錄實驗數(shù)據(jù)，而是可以實施更加嚴格的標(biāo)準(zhǔn)。,

28、需證實藥敏試驗的結(jié)果和確認菌種的鑒定,,需證實藥敏試驗的結(jié)果和確認菌種的鑒定,注重培養(yǎng)微生物工作人員的質(zhì)量控制意識,具有質(zhì)量意識的微生物技術(shù)人員 應(yīng)該對標(biāo)準(zhǔn)爛熟于心，能對不常見的結(jié)果提出疑問： 象不可能的或迄今為止從未見過的藥敏表型 出現(xiàn)少見菌或非常駐菌，以及增加的污染率等。各種質(zhì)量控制方法都很難檢查出來 ！ 這些和其他的技術(shù)錯誤或書寫錯誤不是經(jīng)常發(fā)生，或散在發(fā)生 實驗室應(yīng)該鼓勵工作人員