遺傳性疾病的分子診斷

1、遺傳性疾病的分子診斷,上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 樊綺詩(shī)教授,——診斷策略和工具,用分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)基因而達(dá)到診斷疾病的目的是生物學(xué)者在分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展的最初階段就有的設(shè)想。1976年人們開始在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究，1984年以來，基因檢測(cè)在許多國(guó)家已成為常規(guī)項(xiàng)目，主要用于遺傳性疾病的診斷。,一、遺傳性疾病的分類,常染色體連鎖遺傳性疾病 ——致病基因位于常染色體性染色體連鎖遺傳性疾病

2、 ——致病基因位于性染色體,常染色體連鎖遺傳性疾病,常染色體隱性遺傳——位于一對(duì)常染色體上的兩個(gè)等位基因均發(fā)生突變才能產(chǎn)生臨床癥狀，此時(shí)所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病即為常染色體連鎖隱性遺傳性疾病。同一對(duì)染色體中只有一個(gè)等位基因發(fā)生突變的個(gè)體稱為雜合子，二個(gè)等位基因均發(fā)生突變的個(gè)體稱為純合子。囊性纖維變：常染色體連鎖隱性遺傳(7q31),,常染色體連鎖顯性遺傳——位于一對(duì)常染色體上的二個(gè)等位基因之一發(fā)生突變即產(chǎn)生臨

3、床癥狀，所導(dǎo)致的相應(yīng)疾病即為常染色體連鎖顯性遺傳性疾病。特點(diǎn)：家系中患者數(shù)目較多，大多情況下每一代均有患者。Huntington舞蹈癥：常染色體顯性遺傳(4p16.3),性染色體連鎖遺傳性疾病,X染色體連鎖遺傳：大多為隱性 (如甲型血友病、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)，顯性遺傳非常罕見。Y染色體連鎖遺傳,二、遺傳性疾病中常見的分子異常,遺傳性疾病的產(chǎn)生是由于一個(gè)（或數(shù)個(gè)）基因發(fā)生異常導(dǎo)致這些基因所載有的遺傳信息受到改變，而發(fā)病是通過遺傳

4、物質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)（或酶）的表現(xiàn)異常所致?；蛲蛔冎饕ㄈ箢?，即點(diǎn)突變、片段性突變和動(dòng)態(tài)性突變。,（一）點(diǎn)突變,點(diǎn)突變：DNA分子中單個(gè)堿基的替換終止密碼子突變：點(diǎn)突變導(dǎo)致提前產(chǎn)生終止密碼，或終止密碼突變而編碼一個(gè)氨基酸使肽鏈延長(zhǎng)。錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變,,,各種點(diǎn)突變所造成的后果：蛋白質(zhì)分子量改變、蛋白質(zhì)合成量下降、無蛋白質(zhì)合成。,（二）片段性突變,核苷酸的丟失和增多缺失：基因中鹼基（遺傳物質(zhì)）的丟失插入

5、：外來基因片段插入某一基因序列中倍增：基因內(nèi)部某一段序列發(fā)生重復(fù)基因重排：基因組中原來不在一起的基因 由于某些原因組合排列在一起。,（三）動(dòng)態(tài)性突變,以三核苷酸為單位的重復(fù)序列，在傳遞過程中不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生擴(kuò)展，即子代的重復(fù)次數(shù)往往較親代大為增加，因此又稱動(dòng)態(tài)性突變。 脆性X綜合征：CGG重復(fù) 少年脊髓型共濟(jì)失調(diào)：GAA重復(fù) ……,三、遺傳性疾病基因診斷的策略,（一）直接診斷策略 基因診斷的直接策

6、略就是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因的遺傳缺陷，因此直接診斷的前提是被檢測(cè)基因的正常序列和結(jié)構(gòu)必須被闡明。 直接診斷由于是直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。,,（二）間接診斷策略,間接診斷的實(shí)質(zhì)是在家系中進(jìn)行連鎖分析，通過分析可確定個(gè)體來自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體，從而判斷該個(gè)體是否帶有致病基因。 間接診斷不是尋找 DNA 的遺傳缺陷，而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性估計(jì)被檢者患病的可能性。,,四

7、、基因診斷所采用的技術(shù),(一) 直接診斷所采用的技術(shù),DNA片段性突變的檢測(cè) （1）Southern 印跡技術(shù) 將基因組DNA用限制性酶水解成無數(shù)片段經(jīng)凝膠電泳后用堿處理使凝膠中的DNA變性為單鏈，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用標(biāo)記探針與變性單鏈雜交，可使特異條帶顯影。,（2）多重PCR技術(shù),在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中放入多對(duì)引物，當(dāng)基因的外顯子發(fā)生缺失時(shí)，根據(jù)條帶缺失的數(shù)目和引物相應(yīng)的位置，可判斷基因中哪一

8、個(gè)或哪幾個(gè)擴(kuò)增部位發(fā)生缺失。,2. 點(diǎn)突變,（1） 已知點(diǎn)突變的檢測(cè)方法 a）PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi)，可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離，可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。,b）等位基因特異性寡核苷酸雜交,被檢基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)移到膜上

9、，分別與長(zhǎng)度為15~20bp、經(jīng)標(biāo)記的正常序列和突變序列的寡核苷酸探針雜交。由于20個(gè)堿基中僅一個(gè)堿基差異即可使DNA分子的Tm值下降 5~7.5℃，因此通過嚴(yán)格控制雜交條件，可使PCR產(chǎn)物僅與完全互補(bǔ)的探針雜交，根據(jù)有無雜交信號(hào)即可判斷被檢者的擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)。,C）PCR-ELISA,將PCR產(chǎn)物用ELISA方法加以檢測(cè)的技術(shù)。在對(duì)目的基因擴(kuò)增時(shí)，dNTP中同時(shí)混有用生物素標(biāo)記的Bio-16-dUTP，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)

10、記。若該產(chǎn)物能與突變點(diǎn)特異的寡核苷酸探針（3’端地高辛11-DIG-ddUTP標(biāo)記）雜交，則該產(chǎn)物便帶有地高辛標(biāo)記信號(hào)，可利用與抗地高辛抗體共價(jià)結(jié)合的酶標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng)，從而判斷突變的存在。,d）寡核苷酸連接檢測(cè)（oligonucleotide ligation assay，OLA）,——設(shè)計(jì)2個(gè)探針（探針A和B），探針A、B分別位于被檢片段的5’和3’端，探針A的3’端與探針B的5’端緊鄰，A探針的5’端和B探針的3’端分別用生

11、物素和地高辛標(biāo)記。設(shè)計(jì)引物時(shí)使突變位點(diǎn)位于A探針的3’末端處。被檢標(biāo)本經(jīng)PCR反應(yīng)后，使產(chǎn)物變性，同時(shí)與兩個(gè)探針雜交，根據(jù)ELISA顯色反應(yīng)檢測(cè)有無連接產(chǎn)物的形成即可知PCR產(chǎn)物中是否含有突變點(diǎn)。,e）DNA芯片技術(shù)（DNA chip）,在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龍膜等）表面有序地陣列一系列固定于一定位置的分子（探針），當(dāng)標(biāo)記樣品（如用化學(xué)熒光法、化學(xué)發(fā)光法標(biāo)記）與探針進(jìn)行雜交后，用共聚焦熒光自動(dòng)掃描等技術(shù)獲取信息，經(jīng)計(jì)算機(jī)系

12、統(tǒng)處理、分析后得到結(jié)果。,,目前主要有2種類型：基片上就位合成寡核苷酸點(diǎn)陣芯片(ONA）和微量點(diǎn)樣技術(shù)制作cDNA點(diǎn)陣芯片（CDA）。,（2）未知點(diǎn)突變的檢測(cè)方法,a) 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand conformational polymorphism，SSCP） 突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生兩條與正常 DNA構(gòu)象不同的單鏈，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電 泳時(shí)，不同構(gòu)象的片段顯示不同的電泳遷

13、移率，從 而能區(qū)別正常與突變的DNA。SSCP只適用于檢測(cè) 150~200bp長(zhǎng)度的DNA片段。 不同順序 不同構(gòu)象 不同電泳行為,,,b) 變性梯度凝膠電泳（DGGE）,利用不同序列的DNA分子具有不同的融點(diǎn)溫度(Tm)的特性。設(shè)計(jì)引物時(shí)使被擴(kuò)增的目的片段含有2個(gè)不同的區(qū)域，一個(gè)Tm較高，另一個(gè)較低，將該P(yáng)CR產(chǎn)物在由變性劑形成的梯度凝膠上進(jìn)行電泳，由于正常

14、序列的PCR產(chǎn)物與突變的 PCR 產(chǎn)物的Tm不同，在電泳過程中Tm較低的區(qū)域被部分解鏈的先后不同，造成電泳遷移率的變化也不同，最后在凝膠中所處的電泳位置也不同，據(jù)此可以區(qū)別正常片段與突變片段。,c)異源雙鏈分析（heteroduplex analysis，HA）,正常DNA和突變DNA在一起變性后再緩慢復(fù)性，可使兩者互補(bǔ)形成異源雜合雙鏈，并在錯(cuò)配處形成一個(gè)凸起。在非變性凝膠電泳時(shí)，異源雙鏈片段會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙鏈片段不同的遷移率，從

15、而使二者分開。,d) 熔點(diǎn)曲線分析(melting curve analysis）,DNA片段中突變堿基與正常堿基不能配對(duì)而形成異源雙鏈，所產(chǎn)生的Tm較完全配對(duì)的同源雙鏈的Tm低，在儀器上顯示出不同的曲線從而將突變序列檢測(cè)出來。所需儀器如高效液相色譜儀(DHPLC)、WAVE DNA片段分析系統(tǒng)、LightCycler等。,e)雙脫氧指紋圖譜（dideoxy fingerprinting，ddF）,是將SSCP和Sanger

16、雙脫氧測(cè)序法結(jié)合起來的一種突變檢測(cè)方法。將PCR產(chǎn)物純化后用與 2 條雙鏈各自互補(bǔ)的兩個(gè)引物分別做sanger測(cè)序反應(yīng)，但不同的是僅加入一種雙脫氧核苷，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)突變性質(zhì)電泳圖譜上會(huì)顯示丟失或獲得一條帶或者至少有一條帶的遷移率會(huì)發(fā)生改變。,f.DNA序列分析（DNA sequencing）,Sanger測(cè)序技術(shù)： 以待測(cè)序列的單鏈DNA作為模板，加入一個(gè)引物和dNTP作為底物，并加入一定比例的2’，3’-d

17、dNTP，在DNA聚合酶的作用過程中，正常dNTP的摻入使鏈延伸，若ddNTP的摻入則使鏈終止，這樣就可以得到一系列長(zhǎng)度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。,g)蛋白截短測(cè)試驗(yàn)（protein truncation test，PTT）,從蛋白質(zhì)水平檢測(cè)由于堿基突變導(dǎo)致終止密碼產(chǎn)生而使蛋白質(zhì)合成提前終止產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)。將正常人和病人的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物在

18、體外經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，在無細(xì)胞提取液中能被翻譯而合成蛋白質(zhì)。所合成的蛋白質(zhì)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)比正常蛋白質(zhì)截短的蛋白質(zhì)。,3. 動(dòng)態(tài)突變的檢測(cè),PCR技術(shù) Southern印跡技術(shù),,4.基因表達(dá)異常的檢測(cè),定量PCR技術(shù) 1. DNA結(jié)合染料技術(shù) 2. 水解探針技術(shù)(又稱TaqMan probe)技術(shù) 3. 雜交探針技術(shù)(又稱熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù) (fluorescence resonance

19、 energy transfer, FRET),（二）間接診斷所采用的技術(shù),1. 雙等位基因多態(tài)性限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP） 第一代DNA的遺傳標(biāo)記，具雙等位基因（bi-allele）多態(tài)性，所含信息量有限。 檢測(cè)方法：Southern印跡技術(shù),2. 多等位基因多態(tài)性,小衛(wèi)星序列　　　又稱串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（variable number tandem

20、repeats，VNTR), 第二代DNA的遺傳標(biāo)記，以6 ~70bp為單位，可重復(fù)數(shù)次至數(shù)十次，以串聯(lián)形式排列，構(gòu)成數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)序列。等位基因常常達(dá)10 個(gè)以上，信息量比RFLP大得多。 檢測(cè)方法：Southern印跡或PCR技術(shù),,微衛(wèi)星序列 (microsatellite) 以2~6bp為單位，重復(fù)次數(shù)可達(dá)幾十次，又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(STR) 。在基因組中出現(xiàn)的數(shù)目和頻率不同，分布廣泛，具高度多態(tài)性

21、。,3. 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）,第三代DNA的遺傳標(biāo)記，其多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的變異。在人類基因組中的數(shù)目可達(dá)300萬個(gè)，是一種信息量非常大的標(biāo)記系統(tǒng)。 　　檢測(cè)方法：DNA芯片技術(shù),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,C50: C49:

22、 C45: C44: Cjp:,11223,C50: C49: C45: C44: Cjp:,12212,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21121,21313,C50: C49: C45:

23、 C44: Cjp:,21121,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,,12212,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,11223,12212,C50: C49: C45: C44:

24、 Cjp:,21313,C50: C49: C45: C44: Cjp:,21313,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,,,,1,2,,,,,,,,,,,,,,,5.8 5.8 2.8 3.4 4.5

25、 4.5 0.9 0.9 0.9 N N N 4.8 4.8 4.8 5 5 5,5.8 5.8 2.8 5.8 4.5 3.4 4.5 4.5

26、 0.9 0.9 0.9 0.9 N N N N 4.8 4.8 4.8 4.8 5 5 5 5,1 2

27、3 4,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,5.8 2.8 4.8 4.8 1.2 0.9 inv N 5 5,,,,,,,,,,,,2.84.80.9 - 5,2.84.80.9 - 5,,5.8 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,5.8

28、 4.8 1.2 inv 5,5.8 4.8 0.9 N 5,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,,,,（三）間接診斷的不確定性,遺傳標(biāo)記所帶的信息性有限新突變基因重組家系成員不夠完整,五、基因檢測(cè)的標(biāo)本制備,DNA或RNA　來自外周血、體液、分泌物和組織如毛發(fā)、皮膚、肌肉、器官、腫瘤組織等,,產(chǎn)前基因診斷標(biāo)本：　羊水細(xì)胞（16~20周）　絨毛膜細(xì)胞（8~12周）非創(chuàng)傷性