平菇漆酶基因生物信息學(xué)分析和雜優(yōu)-2平菇漆酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)、功能基團(tuán)研究.pdf

1、漆酶（laccase）是一種銅多酚氧化酶，是木質(zhì)素降解酶系之一，在食用菌栽培過(guò)程中，漆酶對(duì)菌絲體扭結(jié)具有促進(jìn)作用，能夠形成較多的子實(shí)體原基，進(jìn)而提高食用菌的產(chǎn)量，且在工業(yè)染料廢水處理等方面有重要作用。依據(jù)平菇基因組數(shù)據(jù)，真菌木質(zhì)素降解酶的編碼基因能在基因組水平上得到統(tǒng)計(jì)和注釋。但是，目前也存在一些亟待解決的問(wèn)題，如功能基因注釋結(jié)果的不準(zhǔn)確性、漆酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理不清楚等。本文通過(guò)對(duì)平菇漆酶的11條基因序列及其推斷氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)

2、分析，為研究漆酶基因的調(diào)控機(jī)理、功能基因組及為本文實(shí)驗(yàn)提供理論指導(dǎo)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)選用尚未報(bào)道的雜優(yōu)-2平菇為實(shí)驗(yàn)材料，從中分離純化出漆酶并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行研究旨在為充分了解雜優(yōu)-2平菇漆酶的理化性質(zhì)及對(duì)漆酶的進(jìn)一步研究、食用菌生產(chǎn)和工業(yè)應(yīng)用等方面提供參考。平菇漆酶基因可能受到N源和來(lái)自外界壓力脅迫調(diào)控，但可能不會(huì)受到培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的影響,除 LACC12外，其余漆酶基因可能會(huì)共同響應(yīng)高濃度的銅離子的壓力而激活平菇漆酶基因的轉(zhuǎn)錄；雜優(yōu)

3、-2平菇漆酶在中性和堿性條件下穩(wěn)定性較好，但該酶的熱穩(wěn)定性較低。二硫鍵在維持雜優(yōu)-2平菇漆酶的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有重要作用。研究結(jié)果如下：
　　1、啟動(dòng)子區(qū)域分析結(jié)果顯示：LACC1-LACC12(LACC5除外)均含有不同的順式作用元件，包括熱激響應(yīng)元件(HSE)、壓力響應(yīng)元件(STRE)、金屬應(yīng)答元件(MRE)、異生物質(zhì)反應(yīng)元件(XRE)、抗氧化響應(yīng)元件(ARE)、CreA因子結(jié)合位點(diǎn)(CreA-bingding site)、氮因

4、子結(jié)合位點(diǎn)(NIT)，還包括CAAT框(CAAT Box)、TATA框(TATA Box)等核心轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。對(duì)漆酶基因編碼區(qū)上游2000 bp和下游2000 bp區(qū)域的限制性酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：LACC1-LACC12(LACC5除外)的限制性酶切位點(diǎn)數(shù)在21～56范圍不等。
　　2、漆酶基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及LACC1-LACC12(LACC5除外)相似性分析結(jié)果顯示：LACC1與秀珍菇（Pleurotus sajor-caju）的

5、LACC2相似性為99.59％；LACC3與秀珍菇（Pleurotus sajor-caju）的LACC5和鳳尾菇（Pleurotus pulmonarius）的LACC7相似性分別為87.90%、87.04%；LACC7與杏鮑菇（Pleurotus eryngii）LACC1相似性為95.96%；LACC10與秀珍菇（Pleurotus sajor-caju）的 LACC4相似性為97.93%，11條漆酶基因聚為三支。
　　3、

6、氨基酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)：11條推斷氨基酸序列聚為4支，在進(jìn)化關(guān)系中，LACC6與LACC8、LACC9與LACC10為一支，親緣關(guān)系最近。氨基酸多序列比對(duì)和BLAST及RPS-BLAST結(jié)果顯示：11條推斷氨基酸序列中均有漆酶特征序列 L1-L4和3個(gè)高度保守的銅氧化酶（Cu-oxidase）結(jié)構(gòu)域；SiganlP4.1及Protcomp9.0結(jié)果顯示：11推斷氨基酸序列中都含信號(hào)肽，且都為外分泌蛋白。
　　4、Protpara

7、m對(duì)11條漆酶推斷氨基酸理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：AI在83.64～92.81；ExtCof1和ExtCof2幾乎沒有差異；除LACC1和LACC10外，其余氨基酸的GRAVY均為負(fù)值；II在32.81～42.04范圍內(nèi)；MW介于55.68～58.87之間；pI在4.53～7.78范圍；除LACC8外，其余氨基酸的TNNCR均高于TNPCR。
　　5、推斷氨基酸理化性質(zhì)和組成分析結(jié)果顯示：理化性質(zhì)分為三簇，ClusterⅠ與 Clus

8、terⅢ、ClusterⅡ與 ClusterⅢ之間存在顯著性差異(P＜0.05)，ClusterⅠ與ClusterⅡ之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；每個(gè)簇內(nèi)的氨基酸理化性質(zhì)差異性在三個(gè)簇之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。氨基酸組成也分為三簇，ClusterⅠ與ClusterⅡ及ClusterⅢ均有顯著性差異(P＜0.05)， ClusterⅡ與 ClusterⅢ間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；ClusterⅠ、ClusterⅡ、Clu

9、sterⅢ內(nèi)的漆酶氨基酸序列組成差異性在三個(gè)簇之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　6、通過(guò)對(duì)雜優(yōu)-2平菇菌絲進(jìn)行液體培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀、 DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fast flow層析和Superdex-200 prep grade層析等方法純化，獲得了電泳純的雜優(yōu)-2平菇漆酶。結(jié)果顯示，培養(yǎng)第6天時(shí)漆酶活性最高；雜優(yōu)-2平菇漆酶比活力為115 U/mg，純化倍數(shù)為111.6

10、5，回收率為6.96%。分子質(zhì)量約為244.0 kD，亞基分子質(zhì)量約為85.6 kD。最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度分別為5.0和55℃，在pH6.0～8.0及40～55℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適條件下，以2,2’-連氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS）為底物的 Km值為2.1 mmol/L，最大反應(yīng)速率（Vmax）為0.117

11、μmol/（min·L）。Fe2+、抗壞血酸對(duì)該酶活性具有完全抑制作用，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、Ag+、Mg2+、Li+對(duì)該酶活性影響較小；草酸、甲醇、正丁醇、K+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Mn2+、Co2+對(duì)該酶活性有不同程度的抑制作用；Cu2+激活作用不明顯；尿素、乙醇、異丙醇對(duì)該酶活性具有激活作用。
　　7、化學(xué)修飾劑對(duì)雜優(yōu)-2平菇漆