植物細(xì)胞培養(yǎng)

1、,第二章 植物組織與細(xì)胞培養(yǎng),2.1 植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)別組織培養(yǎng)概念：指從機(jī)體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，模擬機(jī)體內(nèi)生理?xiàng)l件，在體外進(jìn)行培養(yǎng)，使之生存或生長(zhǎng)成組織。細(xì)胞培養(yǎng)概念：植物細(xì)胞在體外條件下的存活或生長(zhǎng)，此時(shí)細(xì)胞不再形成組織。,,,2.2 植物組織的發(fā)展簡(jiǎn)史,①探索階段（本世紀(jì)初~30年代中） 1902年，德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlanclt首次進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) ②奠基階段（30~50年代） 1934年，

2、White 等用番茄根尖的組織培養(yǎng)，建立了第一個(gè)活躍生長(zhǎng)的無(wú)性繁殖系。 1943年White正式提出植物細(xì)胞具有全能性學(xué)說(shuō)，即單細(xì)胞經(jīng)過(guò)人工培養(yǎng)，通過(guò)細(xì)胞分裂能恢復(fù)完整植株。 1934年，White 和Went 等分別發(fā)現(xiàn)B族維生素和吲哚乙酸（IAA）對(duì)培養(yǎng)的離體根生長(zhǎng)具有重要作用。1937-1938年， Gautheret、Nobecourt 培養(yǎng)胡蘿卜根和馬鈴薯的塊莖薄壁組織，獲得愈傷組織。將愈傷組織置于瓊脂培養(yǎng)基上繼續(xù)

3、培養(yǎng)，可無(wú)限發(fā)生細(xì)胞增殖。,,,White、Gautheret、Nobecourt 等科學(xué)家被譽(yù)為植物組織培養(yǎng)的奠基人 1957年Skoog和Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通過(guò)改變培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素高促進(jìn)根的分化，低促進(jìn)莖和芽的分化。1958年，施圖爾德從胡蘿卜愈傷組織獲得單細(xì)胞，并經(jīng)誘導(dǎo)形成了胚狀體再生了植株，是世界上首次證明植物細(xì)胞的全能性。③迅速

4、發(fā)展階段（60年代后） 1、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合。 2、微繁技術(shù),,2.3 植物組織培養(yǎng)重要概念和理論基礎(chǔ),植物組織培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，或潛伏芽等，或長(zhǎng)成完整的植株，統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng) 。,,,植物組織培養(yǎng)理論基礎(chǔ)一、細(xì)胞全能性二.細(xì)胞分化 三.離體培養(yǎng)中細(xì)胞的脫分化、再分化,,,全能性：任何有完整的細(xì)胞核的

5、植物細(xì)胞擁有形成一個(gè)完整植株所必需的遺傳信息，理論上都能發(fā)育成為一棵植株。 植物組織培養(yǎng)是建立在細(xì)胞具有全能性的理論基礎(chǔ)上的，除受精卵能發(fā)育成胚外，植物的體細(xì)胞，雌配子、雄配子體都能發(fā)育成胚。,,,植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱: 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中心 > 形成層 > 薄壁細(xì)胞 > 厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞) > 特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)； 根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為： 頂端分生組織 &

6、gt; 居間分生組織 > 側(cè)生分生組織 > 薄壁組織(基本組織) > 厚角組織 > 輸導(dǎo)組織 > 厚壁組織。,,,,脫分化 再分化 外植體―→愈傷組織 ―→ ↗體細(xì)胞胚 ↘ ↘根、莖、葉

7、 等器官再分化時(shí)，可經(jīng)過(guò)兩條途徑,,,,完整植株,,外植體：植物組織培養(yǎng)中用來(lái)進(jìn)行離體無(wú)菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體。愈傷組織：由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散排列的薄壁細(xì)胞。,,,,,,,二、細(xì)胞分化分化：細(xì)胞的這種在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生永久性（不可逆轉(zhuǎn)性）適度變化的過(guò)程。分化的結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞分裂能力的喪失，伴隨的是細(xì)胞的分化成熟與組織的形成

8、，是植物根、莖、葉、花、果實(shí)和種子的形成，是一個(gè)成熟植物體的出現(xiàn)。,,三.離體培養(yǎng)中細(xì)胞的脫分化、再分化脫分化：由失去分裂能力的細(xì)胞回復(fù)到分生性狀態(tài)并進(jìn)行分裂，形成無(wú)分化的細(xì)胞團(tuán)即愈傷組織的現(xiàn)象。再分化：由無(wú)分化的愈傷組織的細(xì)胞再轉(zhuǎn)變成為具有一定結(jié)構(gòu)，執(zhí)行一定生理功能的組織，構(gòu)成一個(gè)完整的植物體或植物器官的現(xiàn)象,,一個(gè)已分化細(xì)胞要表達(dá)出其全能性，就要經(jīng)過(guò)脫分化和再分化的過(guò)程，這就是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)所要達(dá)到的目的。,,影響細(xì)胞脫分化

9、、再分化的因素A、激素 生長(zhǎng)素能促進(jìn)維管組織形成 細(xì)胞分裂素與木質(zhì)部的發(fā)生有關(guān)b、蔗糖濃度 C、光照與溫度光照對(duì)于維管組織的分化具有促進(jìn)作用，適宜的溫度對(duì)于維管組織的分化是必需的。,,再分化時(shí)，可經(jīng)過(guò)兩條途徑 1、器官發(fā)生途徑2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑,1、器官發(fā)生途徑,植物的離體器官的發(fā)生：培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過(guò)程。離體培養(yǎng)中通過(guò)器官發(fā)生形成再生植株大體上有四種方式：

10、A: 先芽后根；如小麥，蘆薈、蘋(píng)果 B: 先根后芽；如枸杞、苜蓿C:在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過(guò)維管組織的聯(lián)系形成完整植株。如胡蘿卜、石刁柏 D:僅有根或芽再生，形成無(wú)芽的根或無(wú)根的芽。,,器官分化的過(guò)程:愈傷組織再分化器官一般要經(jīng)過(guò)三個(gè)生長(zhǎng)階段1.外植體經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)形成愈傷組織。2.生長(zhǎng)中心的形成。當(dāng)把愈傷組織轉(zhuǎn)移到有利于有序生長(zhǎng)的條件下以后，首先在若干部位成叢出現(xiàn)類似形成層的細(xì)胞群，稱之為生長(zhǎng)中心或擬分生組織，它

11、們是愈傷組織形成器官的部位。3.器官原基及器官形成。生長(zhǎng)中心形成后，按照其已確立的極性，某些細(xì)胞開(kāi)始分化形成不同的器官原基，進(jìn)而分化出相應(yīng)的組織和器官。,,,愈傷組織分化不定芽,,,愈傷組織分化期,,,,,2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑,胚狀體發(fā)生途徑形成植株的特征1、具有兩極性 細(xì)胞發(fā)育早期階段，從其相反的兩端分化出芽端與根端，而不定芽和不定根都是單向極性。2、胚狀體的維管組織與外植體的維管組織無(wú)解剖結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，而不定芽和不定根往

12、往總是與愈傷組織的維管組織相聯(lián)系3、胚狀體的維管組織的分布是獨(dú)立的“Ｙ”形，而不定芽和不定根的維管組織無(wú)此現(xiàn)象。4、發(fā)育過(guò)程與合子胚相似。并具有與合子胚類似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，可獨(dú)立萌發(fā)形成小苗。,,,2.4 植物組培的實(shí)驗(yàn)條件,準(zhǔn)備室：進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作：器皿洗滌、培養(yǎng)基配制與分裝、培養(yǎng)基和培養(yǎng)器皿的滅菌、培養(yǎng)材料的預(yù)處理等要求：20平方米左右。要求寬敞明亮設(shè)備：清洗區(qū)，干燥箱，工作臺(tái)，水箱，天平，滅菌鍋等。 無(wú)菌操作室：

13、 也叫接種室，進(jìn)行材料的立體無(wú)菌操作，是植物離體培養(yǎng)研究或生產(chǎn)中最關(guān)鍵的一步。要求：10-20平方米即可，封閉性好，干燥清潔，能較長(zhǎng)時(shí)間保持無(wú)菌.設(shè)備：超凈工作臺(tái)，紫外燈和空調(diào),,培養(yǎng)室： 對(duì)接種到培養(yǎng)瓶等器皿中的植物離體材料進(jìn)行控制條件下的培養(yǎng)要求：約需10-20平方米左右。基本要求是能夠控制光照和溫度，并保持相對(duì)的無(wú)菌環(huán)境，設(shè)備：培養(yǎng)架、光照培養(yǎng)箱或人工氣候箱、溫濕度計(jì)、空調(diào)等。緩沖間：是進(jìn)入無(wú)菌室前的一個(gè)緩沖場(chǎng)地，減少人

14、體從外界帶入的塵埃等污染物。工作人員在此換上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能進(jìn)入無(wú)菌室和培養(yǎng)室。要求：緩沖間需3-5平方米，可建在準(zhǔn)備室外或無(wú)菌操作室外，應(yīng)保持清潔無(wú)菌；備有鞋架和衣帽掛鉤，并有清潔的實(shí)驗(yàn)用拖鞋、已滅菌過(guò)的工作服；墻頂用1-2盞紫外燈定時(shí)照射，對(duì)衣物進(jìn)行滅菌。設(shè)備：1-2盞紫外燈、滅菌后的工作服、拖鞋、口罩。,,,基本實(shí)驗(yàn)室 －－－－－準(zhǔn)備室,,,,,,,,,,,,,培養(yǎng)室,,,,,,2.5 植物組織培養(yǎng)步驟,植物組織培

15、養(yǎng)兩個(gè)步驟：1、植物細(xì)胞或組織脫分化，形成愈傷組織。2、愈傷組織形成分生細(xì)胞團(tuán)，再分化成不同的器官。 有的情況下，組織細(xì)胞經(jīng)脫分化后，不形成愈傷組織，而是從脫分化的細(xì)胞上直接再分化器官 到底通過(guò)哪個(gè)途徑再生，取決于培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基，尤其培養(yǎng)基中添加激素的種類、濃度及配比,,1、培養(yǎng)材料的采集選擇具全能性細(xì)胞：受精卵、分生組織細(xì)胞、雌雄配子及單倍體細(xì)胞常用植物莖尖、下胚軸、幼葉作為外植體?？紤]因素：材料的來(lái)源、外植體

16、年齡、產(chǎn)地、外植體的大小、形狀、生理部位。,,（1）最常用的組培材料： 莖尖、莖段、皮層、表皮、維管組織、塊莖、花瓣、根、葉、子葉、胚珠、花藥等。 ① 莖尖：形態(tài)已建成，繁殖率高，不易產(chǎn)生變異。莖尖最先端為無(wú)病毒區(qū)。通常為0.5cm，無(wú)病毒區(qū)為0.1mm。 缺點(diǎn)：數(shù)量少，取材有限。 ② 莖段：一般為0.5～1cm長(zhǎng)，取材方便。 缺點(diǎn)：所獲得的愈傷組織來(lái)源不一，有異質(zhì)性，再生植株易產(chǎn)生變異。,,③ 葉：取材

17、方便，再生能力強(qiáng) 。 ④ 花器官：取材包括花托、花瓣、花藥、子房等。⑤ 種子（果實(shí)）：無(wú)菌種子發(fā)芽后可作外植體。子葉和下胚軸也可培養(yǎng)。,,2、培養(yǎng)材料消毒A:自來(lái)水沖洗、蒸餾水沖洗、無(wú)菌濾紙吸干。B:無(wú)菌操作將材料放入70%酒精浸泡30-60sC:將材料移入Naclo飽和液或0.01%升汞消毒8-10min。D:取出無(wú)菌水沖洗。,3、制備外植體：用消毒過(guò)的器械無(wú)菌操作將外植體置于培養(yǎng)皿上。 切取外植體為適當(dāng)大小，一般0.2

18、-0.5cm。 4、接種和培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分一般為基本培養(yǎng)基+細(xì)胞分裂素+生長(zhǎng)素+附加成分, 基本培養(yǎng)基一般選擇MS配方（1）接種：每瓶約4～10個(gè) （2）封口 （3）培養(yǎng)條件：溫度為25+2℃ 光照為1000～4000lx pH值常為5.6～6.0 培養(yǎng)室的相對(duì)濕度要常保持在70～80%。,,5、增殖 把在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分化出的幼芽繼代培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)到增殖

19、培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng), 這是使幼芽快速增殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。6、根的誘導(dǎo) 繼代培養(yǎng)的不定芽或側(cè)芽需要生根培養(yǎng)，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)一個(gè)月左右方可獲得根系。 7、組培苗的練苗移栽,,,煉苗與移栽,,,,切取,,,,,,,,,,,2.6 愈傷組織形成的過(guò)程,外植體中已分化的活細(xì)胞，在外源激素的誘導(dǎo)下通過(guò)脫分化后形成愈傷組織，這一過(guò)程被大致劃分為三個(gè)時(shí)期誘導(dǎo)期分裂期形成期,1、誘導(dǎo)期：細(xì)胞分裂的準(zhǔn)備期 誘導(dǎo)期是細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂，需加入誘導(dǎo)

20、劑或細(xì)胞分裂素。2、分裂期：細(xì)胞從開(kāi)始分裂到持續(xù)分裂的時(shí)期 。分裂期的愈傷組織的共同特征是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，缺少有組織的結(jié)構(gòu)，維持其不分化的狀態(tài)。,3、分化期：從愈傷組織到器官發(fā)生 。其間受很多因素影響。,,,愈傷組織的形態(tài),,,,愈傷組織的顏色,,愈傷組織的種類 1、胚性愈傷組織：表面光滑、組織結(jié)構(gòu)緊湊、細(xì)胞小、再生力強(qiáng)。 胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。 2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松

21、、細(xì)胞大。,,,,,復(fù) 習(xí),愈傷組織再分化經(jīng)歷兩個(gè)途徑：器官發(fā)生方式再生植株的三種 途徑： ① 可能先長(zhǎng)芽后長(zhǎng)根（常見(jiàn)）。 ② 形成根，根上再長(zhǎng)出芽（少見(jiàn)）。 ③ 在愈傷組織不同部位分別形成根和芽。,,胚狀體形成途徑 胚狀體：指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀結(jié)構(gòu)。 體細(xì)胞胚與合子胚發(fā)育過(guò)程相似： 原胚 → 球形胚 → 心形胚 → 魚(yú)雷形胚 → 子葉型胚,,,胚狀體發(fā)生途徑,,外

22、 植 體 ↓ 高濃度生長(zhǎng)素（2,4-D） 脫 分 化 ↓ 愈傷組織 ↓ 高（細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素） 再 分 化 ↓ 形 成 芽 ↓ 低（細(xì)胞分裂素/生長(zhǎng)素） 分 化 根

23、↓ 完整植株,,,,,激素控制器官分化模式圖,植物組織培養(yǎng)舉例,一、材料和培養(yǎng)基l0-l5cm高的蘆薈幼苗;愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+(1一6mg/ L)BA+(0.1一0.5mg/L)NAA;分化培養(yǎng)基為MS+(2-4mg/L)BA+ (0.1-0.5mg/L)NAA;生根培養(yǎng)基為MS+(0.1一0.5mg/L)IBA+(2一5mg/L)PP33。,二、繁殖方法 (一)愈傷組織培養(yǎng) 將準(zhǔn)備好的蘆薈幼苗在

24、清水中沖洗數(shù)次，剪去葉片和大部分莖段，取莖尖部分，再?zèng)_洗1-2次，淋干。在超凈臺(tái)上，先用75%的乙醇將莖尖浸泡30-60s，再用升汞浸5-l0min，最后用無(wú)菌水沖洗數(shù)次。用解剖刀取出包括莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的組織切塊，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。大約15-25d后，試管中接種的外植體就可以膨大，形成愈傷組織。愈傷組織的形成標(biāo)志著接種的外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)已脫離分化狀態(tài)，開(kāi)始重新恢復(fù)分生能力。愈傷組織形成1周后，就可將愈傷組織轉(zhuǎn)管進(jìn)行繼代培養(yǎng)或分化培

25、養(yǎng)。(二)繼代培養(yǎng) 將愈傷組織在無(wú)菌條件下，用解剖刀將愈傷塊切成數(shù)個(gè)小塊，再接種到裝有愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中，在與誘導(dǎo)愈傷組織相同的培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)。幾天后，小愈傷塊即可逐漸長(zhǎng)大，這一過(guò)程稱作繼代培養(yǎng)。通過(guò)愈傷組織的繼代培養(yǎng)，原來(lái)接種的1個(gè)蘆薈莖尖組織可繁殖出大量的新接種材料來(lái)，用于分化培養(yǎng)。,(三)分化培養(yǎng) 將愈傷組織在無(wú)菌條件下，從試管或三角瓶中取出，用無(wú)菌水洗凈，切成小接種塊，接種到裝有分化培養(yǎng)基的三角瓶中，分化培養(yǎng)的條

26、件同愈傷組織培養(yǎng)。大約30-50d后，愈傷組織就可分化出芽，并繼續(xù)長(zhǎng)出小葉片。當(dāng)分化出的幼苗長(zhǎng)到一定高度或分化出一定數(shù)量后，將這些小幼苗在無(wú)菌條件下取出，進(jìn)行生根培養(yǎng)或重新誘導(dǎo)分化。(四)生根培養(yǎng) 當(dāng)三角瓶中的幼苗葉片長(zhǎng)到3cm左右時(shí)，將幼苗在無(wú)菌條件下取出，放入裝有生根培養(yǎng)基的三角瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同分化培養(yǎng)。大約半個(gè)月后，幼苗即可生根。(五)煉苗 當(dāng)幼苗的根長(zhǎng)到一 定長(zhǎng)度，幼苗形體已顯健壯時(shí)。將幼苗取出，在清水中洗除附著在根上的

27、培養(yǎng)基(注意:一定要嚴(yán)格洗凈，否則會(huì)爛根)。(六)移栽 煉苗后，將幼苗移栽入由蛭石組成的馴化苗圃中馴化，每天定期給幼苗噴施馴化培養(yǎng)液和清水，大約15-20d后，視幼苗長(zhǎng)勢(shì)，即可移栽到苗圃中。,,,1、在植物育種上的應(yīng)用 突變育種：無(wú)論是愈傷組織培養(yǎng)還是細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條件和外界壓力的影響而產(chǎn)生誘變，從中可以篩選出對(duì)人們有用的突變體，從而育成新品種。原生質(zhì)體融合和細(xì)胞雜交：可部分克服有性雜交不親和性

28、，而獲得體細(xì)胞雜種，從而創(chuàng)造新種或育成優(yōu)良品種。單倍體育種：利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)花粉形成單倍體，在試管培養(yǎng)中通過(guò)秋水仙素處理，使染色體加倍，而成為純合二倍體植物，從而縮短新品種育種的時(shí)間，還有利于突變中隱性突變的分離。,2.7 植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用,,,2、在植物脫毒和快速繁殖上的應(yīng)用　植物脫毒和離體快速繁殖是目前植物組織培養(yǎng)應(yīng)用最多、最有效的一個(gè)方面。很多農(nóng)用物都帶有病毒，特別是無(wú)性繁殖植物，但是，患病植株并非每個(gè)部位都帶有病毒，利

29、用組織培養(yǎng)方法，取一定大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)，再生的植株有可能不帶病毒，從而獲得脫病毒苗，再用脫毒苗進(jìn)行繁殖，則種植的作物就不會(huì)或極少發(fā)生病毒。,,,,,馬鈴薯脫病毒試管苗,,由于組織培養(yǎng)法繁殖作物的突出特點(diǎn)是快速，因此，對(duì)一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖的“名、優(yōu)、特、新、奇”作物品種的繁殖，意義更大。對(duì)于脫毒苗、新育成、新引進(jìn)、稀缺育種、優(yōu)良單株、瀕危植物和基因工程植株等可通過(guò)離體快速繁殖，同時(shí)可不受地區(qū)、氣候的影響，比常規(guī)方法快數(shù)萬(wàn)倍到

30、數(shù)百萬(wàn)倍的速度擴(kuò)大繁殖，及時(shí)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種薯和種苗。,,3、在植物種質(zhì)資源保存和交換上的應(yīng)用 由于自然災(zāi)害和生物之間的競(jìng)爭(zhēng)以及人類活動(dòng)對(duì)大自然的影響，已有相當(dāng)數(shù)量的植物物種在地球上消失或正在消失。具有獨(dú)特遺傳性狀的生物物種的絕跡是一種不可挽回的損失。利用植物組織和細(xì)胞法低溫保存種質(zhì)，給保存和搶救有用基因帶來(lái)了希望。例如胡蘿卜和煙草等植物的細(xì)胞懸浮物，在-20℃至-196℃的低溫下貯藏?cái)?shù)月，尚能恢復(fù)生長(zhǎng)，再生成植株。,2.8 人工種子

31、,2.8.1 人工種子理論基礎(chǔ)胚狀體： 是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個(gè)非合子細(xì)胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀結(jié)構(gòu)，又稱體細(xì)胞胚。 A: 體細(xì)胞胚胎發(fā)生特點(diǎn)1、是離體培養(yǎng)的產(chǎn)物2、起源于非合子細(xì)胞3、發(fā)育過(guò)程與合子胚相似，也經(jīng)歷球形期、心形期、 魚(yú)雷期和子葉期階段。,,B: 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑 胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種：,直接從器官外植體上發(fā)生愈傷組織發(fā)生懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生單

32、倍體細(xì)胞發(fā)生原生質(zhì)體發(fā)生,,,,2.8.2 人工種子概念,利用人工種皮包被體細(xì)胞胚可以制造人工種子。 人工種子的結(jié)構(gòu)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種被、胚乳和胚三部分構(gòu)成。 目前研制的人工種子的結(jié)構(gòu): 體細(xì)胞胚 人工種皮 人工胚乳,,,2.8.3 人工種子的基本制作流程 外植體的選擇和消毒—— 愈傷組織的誘導(dǎo)——體細(xì)胞胚的誘導(dǎo) ——體細(xì)胞胚的同步化—

33、—體細(xì)胞胚的分選——體細(xì)胞胚的包裹(人工胚乳)——包裹外膜——發(fā)芽成苗試驗(yàn)——體細(xì)胞胚變異程度與農(nóng)藝研究。,,人工種子制作過(guò)程中，包埋是最重要環(huán)節(jié)包括包埋介質(zhì)的選擇，主要是人工胚乳和人工種皮的選擇人工胚乳一般由含有供應(yīng)胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成,養(yǎng)分包括礦質(zhì)元素、維生素、碳源以及激素等,,對(duì)于人工胚乳包埋介質(zhì)的要求： 首先必需是對(duì)繁殖體及其它生物是無(wú)毒的，并具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。 同

34、時(shí)，它最好能夠提供類似于胚乳的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以供繁殖體發(fā)芽的需要。 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦?。海藻酸鈉作包埋劑,2.8.4 人工種子優(yōu)點(diǎn)：第一，它同微繁殖技術(shù)一樣，培養(yǎng)條件可以人為控制，免遭大自然災(zāi)害性氣候的不利因素，且具有省地省工可直接在田間播種等優(yōu)點(diǎn)。第二，在人工種子制作中，可加入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲(chóng)劑等，這是微繁殖難以達(dá)到的。第三，用于制作人

35、工種子的體細(xì)胞胚，可利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率。第四，一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術(shù)加速用于生產(chǎn)。,2.9 植物細(xì)胞培養(yǎng),2.9.1 概念：離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過(guò)繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖。從而獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。方法：根據(jù)對(duì)象：?jiǎn)渭?xì)胞培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。按培養(yǎng)系統(tǒng)：懸浮培養(yǎng)、液

36、體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)圖3-7,2.9.2 植物單細(xì)胞培養(yǎng),1、單細(xì)胞制備方法由完整的植物器官分離單細(xì)胞由培養(yǎng)組織中分離單細(xì)胞A: 機(jī)械法：通過(guò)機(jī)械磨碎、切割植物體獲得游離單細(xì)胞。B: 酶解法：采用水解酶去除細(xì)胞壁，釋放出細(xì)胞，用來(lái)制備原生質(zhì)體。葉片是分離單細(xì)胞的最好材料,機(jī)械法,,,,,Takebe等（1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞,,C: 愈傷組織誘導(dǎo)法：先獲得愈傷組織，在通過(guò)震蕩獲得單個(gè)細(xì)

37、胞步驟：(1) 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； (2) 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。(3)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。,2、單細(xì)胞培養(yǎng)方法,A: 平板培養(yǎng)法概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，接種在1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)1、單細(xì)胞懸浮液的制備 2、懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制3、瓊脂培養(yǎng)基的配制4、平板制作 5、培養(yǎng),,主要技術(shù)要點(diǎn)： 

38、;單細(xì)胞的分離：一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過(guò)6個(gè)細(xì)胞，因此過(guò)濾時(shí)網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。單細(xì)胞懸浮液的制備：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌2次以后，調(diào)整密度為103或105個(gè)細(xì)胞/ml,,植板：將1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與35℃的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm。 待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)皿封嚴(yán)以防污染.在25℃黑暗條件下培養(yǎng)3周即可長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的愈傷組織。,,特點(diǎn)：?jiǎn)渭?xì)

39、胞在培養(yǎng)集中分布均勻，便于顯微鏡下定點(diǎn)觀察；培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢。,,,,平板培養(yǎng)法,,B: 看護(hù)培養(yǎng)法 用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織塊來(lái)看護(hù)單個(gè)細(xì)胞，并使其生長(zhǎng)和增殖的方法。（1）取處于活躍生長(zhǎng)期約1厘米大小愈傷組織塊。（2）無(wú)菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約1厘米平方的無(wú)菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過(guò)夜。（3）將分離出的單細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。（4）恒溫培養(yǎng)。,,特點(diǎn)：（1）效果好，易于成功。（

40、2）簡(jiǎn)便易行。（3）不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程。,,C: 微室培養(yǎng)法 人工制造一個(gè)小室（載玻片和蓋玻片），將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。小室可通過(guò)毛細(xì)管與外界通氣，便于觀察。,,,微室培養(yǎng),,,,,1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液,周?chē)邮炗?,,,,凹穴載玻片,,旁邊加石蠟油,,,,,,蓋蓋玻片,,,,,,,,蓋蓋玻片,,,,,,,,,,,,,,,,,,置培養(yǎng)皿中26~28 ℃恒溫培養(yǎng),,,特點(diǎn)：

41、在培養(yǎng)過(guò)程中可以連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，將一個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和形成細(xì)胞團(tuán)的全部過(guò)程記錄下來(lái)。,D: 其它單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù) 是用處理過(guò)的、無(wú)活性或分裂慢的細(xì)胞來(lái)飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細(xì)胞，使其分裂和生長(zhǎng)。將飼養(yǎng)細(xì)胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞混合植板，經(jīng)過(guò)照射的細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞起到一個(gè)飼養(yǎng)作用。雙層濾紙植板培養(yǎng)方法,,,,,,,,,,,,,,,,,,,培養(yǎng)基,,飼養(yǎng)層細(xì)胞,,看護(hù)濾紙層,,轉(zhuǎn)移碟濾紙,,培養(yǎng)細(xì)胞,

42、,,E: 懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)是指將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。1、起始培養(yǎng)物的建立選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。2、選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng),,懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一、增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)；可以適當(dāng)改善氣體的交換二、在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累

43、而對(duì)細(xì)胞自身產(chǎn)生毒害；三、適合大規(guī)模培養(yǎng)。生產(chǎn)有價(jià)值次生代謝產(chǎn)物。,,3、建立細(xì)胞懸浮系,,一個(gè)成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個(gè)條件： 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～50個(gè)細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)量一般2～3天甚至更短時(shí)間便可

44、增加一倍。,104,4、懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長(zhǎng)量的計(jì)算,細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞密實(shí)體積（PCV）,5％鉻酸或0.25％果膠酶使懸浮細(xì)胞團(tuán)分散用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。,,將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個(gè) 15ml 的離心管中，2000轉(zhuǎn)下離心，用每ml培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的ml數(shù)表示,細(xì)胞鮮重：細(xì)胞培養(yǎng)物過(guò)濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽慮，稱重。細(xì)胞干重離心收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的濾紙片上，然后在60℃烘12h，在干燥器中冷卻后稱重,5、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

45、的同步化,細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過(guò)細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。1、物理方法1）分選法通過(guò)細(xì)胞體積大小分級(jí)，直接將處于相同周期的細(xì)胞進(jìn)行分選，然后將同一狀態(tài)的細(xì)胞繼代培養(yǎng)于同一培養(yǎng)體系中 。2）冷處理法。低溫處理可以提高培養(yǎng)體系中細(xì)胞同步化的程度,2、化學(xué)方法1）饑餓法 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，若斷絕供應(yīng)一種細(xì)胞分裂所必需的營(yíng)養(yǎng)成分或激素，使細(xì)胞停滯在G1或G2期，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的饑餓之后，當(dāng)在培養(yǎng)基中重新加入

46、這種限制因子時(shí)，靜止細(xì)胞就會(huì)同步進(jìn)入分裂。2）抑制劑法 通過(guò)一些DNA 合成抑制劑處理細(xì)胞，使細(xì)胞停留在DNA 合成前期，當(dāng)解除抑制后，即可獲得處于同一細(xì)胞周期的細(xì)胞。 常用的抑制劑有5-氟脫氧尿苷，5-氨基尿嘧啶、羥基尿等。3）有絲分裂阻抑 用秋水仙素處理指數(shù)生長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物，濃度一般控制在0.2%，處理時(shí)間以4-6小時(shí)為宜,植物細(xì)胞培養(yǎng)的意義,2.10植物次生代謝產(chǎn)物在醫(yī)藥、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。 &

47、#160;李時(shí)珍（1593）在《本草綱目》中所開(kāi)列的1892種藥物絕大多數(shù)是植物藥物，目前仍有約25％的法定藥品來(lái)自植物。其藥物的有效成分均為次生產(chǎn)物。,,許多植物次生代謝產(chǎn)物是優(yōu)良的食品添加劑和名貴化妝品原料。有些是生物毒素的主要來(lái)源，可以用于殺蟲(chóng)、殺菌，而對(duì)環(huán)境和人畜無(wú)害，是理想的環(huán)保產(chǎn)品。例如：從胡蘿卜、萬(wàn)壽菊提取色素從黃菊提取芳香油梔子提取果酸：果酸含有大量的維生素，如維生素C、檸檬酸等。主要用作食品的調(diào)味劑，化妝行業(yè)用于

48、制作護(hù)膚品和洗發(fā)香波等，美容院用作換膚液,2.11 植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng),目前采用液體培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)1、植物細(xì)胞培養(yǎng)的特性a 植物細(xì)胞較微生物細(xì)胞大得多，有纖維素細(xì)胞壁．細(xì)胞耐拉不耐扭，抵抗剪切力差；b 培養(yǎng)過(guò)程生長(zhǎng)速度緩慢，易受微生物污染，需用抗生素；c 細(xì)胞生長(zhǎng)的中期及對(duì)數(shù)期．易凝聚為團(tuán)塊，懸浮培養(yǎng)較難；d 培養(yǎng)時(shí)需供氧，培養(yǎng)液粘度大：e 具有群體效應(yīng)；f 因?yàn)橛屑?xì)胞壁, 培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)量較低；

49、g 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程具有結(jié)構(gòu)與功能全能性,因而易分化,從而導(dǎo)致目的產(chǎn)物低于原植物體內(nèi)的濃度；h 懸浮培養(yǎng)中要求有一定的細(xì)胞濃度，否則不生長(zhǎng)。,2．植物細(xì)胞培養(yǎng)液的流變特性 易結(jié)團(tuán)，易分泌粘性物質(zhì)。傳氧速率降低，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。 3．植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的氣體傳遞與影響 （1）氧的傳遞 （2）CO2的影響,,,4．泡沫與器壁表面黏附性 易產(chǎn)生泡沫，與器壁表面黏附性強(qiáng)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)，要盡量消除。 5．細(xì)胞分裂和愈傷組織的形成

50、 3～5天:發(fā)生細(xì)胞分裂 兩周后:愈傷組織的形成 將其轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上即可最終獲得試管苗。,2、液體懸浮培養(yǎng)理論基礎(chǔ)---細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈現(xiàn)出明顯的由慢到快，再到慢，最后增長(zhǎng)停止的細(xì)胞周期。細(xì)胞的生長(zhǎng)呈S型曲線,滯后期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,直線生長(zhǎng)期,緩慢期,靜止期,1,2,3,4,5,3、懸浮細(xì)胞增殖各個(gè)時(shí)期的特點(diǎn)：,緩慢期,滯后期（延遲期）,細(xì)胞很少分裂，其長(zhǎng)短與接種量大小和繼代時(shí)原

51、種細(xì)胞所處的生長(zhǎng)期有關(guān),對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,細(xì)胞分裂活躍，細(xì)胞數(shù)目增加，增長(zhǎng)速率保持不變,直線生長(zhǎng)期,細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育最明顯的時(shí)期,生長(zhǎng)逐漸緩慢：培養(yǎng)液消耗將盡，有毒代謝物質(zhì)增多，氧氣減少,靜止期,生長(zhǎng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)，細(xì)胞數(shù)目增加極少，甚至開(kāi)始死亡。,4、大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程： （1）細(xì)胞的篩選與細(xì)胞株的建立（固液培養(yǎng)相結(jié)合）篩選細(xì)胞株的方法是：（1）愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)：將切取得材料放在培養(yǎng)基上，愈傷組織形成后，繼代培養(yǎng)。（2）單細(xì)胞

52、分離：挑選出外觀疏松、生長(zhǎng)快的淺色愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，也可加入果膠酶，游離出單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)。（3）無(wú)性系的分離：將懸浮培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾除去細(xì)胞塊，濃縮后接種與固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周。（4）細(xì)胞株篩選：在平板上選擇生長(zhǎng)迅速分散好的胞系的培養(yǎng)物，進(jìn)行有效成分的測(cè)定，篩選出有效成分高而生長(zhǎng)較快的細(xì)胞株。（2）擴(kuò)大培養(yǎng)將優(yōu)良細(xì)胞株多次擴(kuò)大繁殖得到大量細(xì)胞，用作生物反應(yīng)器的種子,(3)生物反應(yīng)器培養(yǎng)培養(yǎng)方式（一

53、）分批培養(yǎng)/成批培養(yǎng)是指細(xì)胞接種到一定容積培養(yǎng)基的密封系統(tǒng)中培養(yǎng)， 它是進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞分裂的生理生化研究常用的培養(yǎng)方法。要進(jìn)行下一批培養(yǎng)，則生長(zhǎng)一定時(shí)間后，需要繼代轉(zhuǎn)移。 特點(diǎn)：（1）細(xì)胞生長(zhǎng)在固定體積的培養(yǎng)基上，直至培養(yǎng)基中的養(yǎng)分為細(xì)胞耗盡為止。（2）用適當(dāng)攪拌的方法增加和維持游離細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)在培養(yǎng)基中的均勻分布。（3）培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)，其數(shù)目不斷發(fā)生變化，呈S增長(zhǎng)。（4）成批培養(yǎng)結(jié)束后，若要進(jìn)行下一批培養(yǎng)，

54、必須另外進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其方法是用注射器吸取一定量的含單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的懸浮培養(yǎng)物，并移到含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶里，繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。,,,最佳繼代時(shí)期： 了解細(xì)胞數(shù)目增長(zhǎng)變化S形曲線后，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和直線 生長(zhǎng)期！,,（二）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種培養(yǎng)后，以一定速度連續(xù)采集細(xì)胞與培養(yǎng)液，以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基，此種培養(yǎng)方式可使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境長(zhǎng)期維持穩(wěn)定,封閉式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中的細(xì)胞數(shù)目不斷增加。開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)：系統(tǒng)中

55、的細(xì)胞密度保持恒定。,,連續(xù)培養(yǎng),加入培養(yǎng)基,排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物,二者體積相等,分：開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)（Open C.C） 封閉式連續(xù)培養(yǎng)（Closed C.C）,,開(kāi)放式和封閉式區(qū)別封閉式中：排出液中的細(xì)胞用機(jī)械方法收集后，又放入原培養(yǎng)基，所以其培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目不斷增加；開(kāi)放式中：在注入新鮮培養(yǎng)基的同時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞隨同培養(yǎng)液一起流出，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目保持恒定；通過(guò)調(diào)節(jié)流入和流出的速度，使培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度永遠(yuǎn)保持接近最高值的恒

56、定水平上。,,（三）半連續(xù)培養(yǎng) 在反應(yīng)器中培養(yǎng)，一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)液進(jìn)行交換或添加某種營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)。 能重復(fù)地取得大量、均一的培養(yǎng)細(xì)胞，供生物研究之用。,5.植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)------生物反應(yīng)器類型機(jī)械攪拌式、鼓泡式和氣升循環(huán)式機(jī)械攪拌式：優(yōu)點(diǎn)：攪拌均勻。缺點(diǎn)：剪切力大。氣動(dòng)式培養(yǎng)系統(tǒng)：優(yōu)點(diǎn)：剪切力小缺點(diǎn)：操作彈性小，低氣速或培養(yǎng)后期混合效果差；此時(shí)如果提高通氣量又會(huì)產(chǎn)生大量泡沫。,,,

57、,機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器,,,,氣動(dòng)式生物反應(yīng)器,6. 植物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)-------培養(yǎng)細(xì)胞和次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的影響因素（1）細(xì)胞遺傳特性 分清代謝物的合成部位或貯藏部位。（2）培養(yǎng)的環(huán)境條件包括光照、溫度、通氣、培養(yǎng)基成分、PH、調(diào)節(jié)因子等培養(yǎng)基成分：培養(yǎng)基的成分包括培養(yǎng)條件要通過(guò)一定的實(shí)驗(yàn)才能選擇出既有利于細(xì)胞大量生長(zhǎng)繁殖又有利于次生代謝產(chǎn)物大量產(chǎn)生的培養(yǎng)基。 通氣：KLa（體積氧傳遞系數(shù)，單位時(shí)間、單位體

58、積氧量）：如在15L的通風(fēng)式反應(yīng)器中培養(yǎng)的煙草細(xì)胞，當(dāng) KLa值在5－10h-1的范圍內(nèi)，隨著 KLa的增加，生物量和代謝產(chǎn)物也呈線性增加 激發(fā)子:植物細(xì)胞次生代謝除了自身的遺傳或發(fā)育基礎(chǔ)外，通常還與誘導(dǎo)因子有關(guān)。人為合理的應(yīng)用這些誘導(dǎo)因子，就有可能提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。,有用次生代謝物質(zhì),,,（3）培養(yǎng)方法(兩階段培養(yǎng)工藝）為了同時(shí)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的需要，通常需要在不同階段使用不同的培養(yǎng)基，即兩階段培養(yǎng),,兩階段培養(yǎng)方法：

59、一步法逐級(jí)放大：對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)與目的產(chǎn)物合成同步的類型，一般采用此方法建立大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)。 兩步法：用于目的產(chǎn)物合成在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育到一定時(shí)期進(jìn)行，細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至合成產(chǎn)物的階段后，再將其轉(zhuǎn)入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。,,植物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)存在的主要問(wèn)題 （1）攪拌或通氣對(duì)細(xì)胞有損傷，泡沫產(chǎn)生、有益氣體散失對(duì)細(xì)胞代謝不利。 （2）培養(yǎng)液粘度增加，影響細(xì)胞吸收營(yíng)

60、養(yǎng)及氣體傳遞。 （3）反應(yīng)器結(jié)構(gòu)有缺陷。 （4）相關(guān)代謝機(jī)制不清楚。,,2.12 植物細(xì)胞兩相培養(yǎng)技術(shù)為了解決產(chǎn)物對(duì)合成的反饋抑制可以采用兩相培養(yǎng)技術(shù)。兩相培養(yǎng)技術(shù)：在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機(jī)物或者具有吸附作用的多聚化合物，是培養(yǎng)體系形成上下兩相，細(xì)胞在水相上生長(zhǎng)，合成的次生代謝物質(zhì)分泌出后轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。,,優(yōu)點(diǎn)： 減少產(chǎn)物反饋抑制 提高產(chǎn)物產(chǎn)量 實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)連續(xù)性,,2.13 生物反應(yīng)器固定化培養(yǎng)

61、固定化培養(yǎng)：是指將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中、培養(yǎng)液成流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的一門(mén)技術(shù)。,,* 細(xì)胞固定化具有以下意義： （1）細(xì)胞生長(zhǎng)較慢，有利于次生代謝物的積累。 （2）易控制化學(xué)環(huán)境、收獲次生代謝產(chǎn)物。 （3）細(xì)胞經(jīng)包埋后受剪切力損傷小。 （4）有利于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉(zhuǎn)化。,,細(xì)胞固定化培養(yǎng)技術(shù)按照其支持物不同可以分為兩大類： 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽b、聚丙烯酰胺

62、等； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。固定化方法：滴入CaCl2使海藻酸鹽形成顆粒,,固定化培養(yǎng)反應(yīng)器：① 流化床生物反應(yīng)器： 細(xì)胞包裹在膠粒、金屬或泡沫顆粒中。 優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞包埋顆粒小，傳質(zhì)效率高。 缺點(diǎn)：剪切力或碰撞破壞細(xì)胞。,,② 填充床生物反應(yīng)器： 細(xì)胞固定在膠粒、金屬或泡沫顆?；蜻B續(xù)多個(gè)網(wǎng)中，或位于支持物表面。細(xì)胞固定不動(dòng)。 優(yōu)點(diǎn)：?jiǎn)挝惑w積容量大。 缺點(diǎn)：混合

63、效率低、傳質(zhì)效率低，顆?；蛩槠鬃枞后w流動(dòng)，高溫變形的固定材料易阻塞。③ 膜生物反應(yīng)器 常用中空纖維和螺線式卷繞反應(yīng)器。 缺點(diǎn)：傳質(zhì)效率低、易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。,,培養(yǎng)技術(shù)的選擇包括對(duì)反應(yīng)器的選擇和對(duì)培養(yǎng)方式的選擇，就目前的技術(shù)基礎(chǔ)來(lái)講，固定化培養(yǎng)是植物細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)較為理想的系統(tǒng)。,2.13 植物原生質(zhì)體培養(yǎng),2.13.1 原生質(zhì)體概念及特點(diǎn)原生質(zhì)體定義：去掉細(xì)胞壁的由質(zhì)膜包裹著的裸細(xì)胞。特點(diǎn)：1、

64、無(wú)細(xì)胞壁障礙，可以方便的進(jìn)行有關(guān)遺傳操作2、具全能性，能人工培育發(fā)育成完整植株。3、適合進(jìn)行誘導(dǎo)融合形成雜種細(xì)胞,,用途： 1、原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁，有利于細(xì)胞融合，體細(xì)胞雜交，基因轉(zhuǎn)移和單細(xì)胞培養(yǎng)。2、原生質(zhì)體能比較容易攝取外來(lái)的遺傳物質(zhì)，作為理想的受體系統(tǒng)進(jìn)行各種遺傳操作的研究，,2.13.2 原生質(zhì)體的分離與純化 原生質(zhì)體材料來(lái)源：葉片，花瓣，果實(shí)組織，子葉等，尤其是葉肉細(xì)胞及由各部分形成的培養(yǎng)細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。分

65、離方法：1、機(jī)械分離法 產(chǎn)生質(zhì)壁分離——釋放原生質(zhì)體2、酶分離法收率高、活力強(qiáng)、完整性好。分離原生質(zhì)體最有效。 分離原生質(zhì)體的酶多是一些復(fù)合酶制劑，以其所含的主要酶的作用分為 1、纖維素酶類 2 半纖維素酶類 3 果膠酶類 4 崩潰酶 5 蝸牛酶。,,原生質(zhì)體分離（以葉片為例） 取材消毒：酶解處理時(shí)把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。對(duì)于懸浮細(xì)胞等材料，如果細(xì)胞團(tuán)

66、的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾一次，將原細(xì)胞團(tuán)去掉，留下較均勻的小細(xì)胞團(tuán)時(shí)再進(jìn)行酶解。,,酶解：1、兩步分離法。用果膠酶離析植物組織，收集細(xì)胞，經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細(xì)胞壁，然后獲得原生質(zhì)體。2、一步分離法。一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對(duì)材料進(jìn)行一次性處理。,,2.13.3 原生質(zhì)體的收集純化方法1、離心沉淀法鎳絲網(wǎng)濾出液 置于離心管（離心2-3分鐘，原生質(zhì)體沉于離心管底部，殘液碎屑懸浮于上清液）

67、 棄去上清液 再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中（反復(fù)3次） 2、漂浮法根據(jù)原生質(zhì)體來(lái)源不同，利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘?jiān)樾汲恋焦艿住?,,,,3、沉降法和漂浮法結(jié)合 將收集的原生質(zhì)體低速離心，傾去上清，將沉降得到的原生質(zhì)體重新懸浮于蔗糖純化液中，離心，收集表面懸浮的原生質(zhì)體。再將原生質(zhì)體重新懸浮于洗滌液中，離心收集沉于底部的原生質(zhì)體。重復(fù)操作,,2.13.4 原生質(zhì)體鑒定

68、與活力測(cè)定一、原生質(zhì)體鑒定1、低滲爆破法：把原生質(zhì)體放入低滲溶液中，顯微鏡下觀察原生質(zhì)體從低滲溶液中吸水漲破的過(guò)程。2、熒光染色法：用熒光增白劑溶液對(duì)原生質(zhì)體染色，在熒光顯微鏡下觀察，綠色顯示纖維素的存在，紅光是沒(méi)纖維素的真正原生質(zhì)體,,二、活力測(cè)定 1、目測(cè)法：在顯微鏡下觀察，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、流動(dòng)性確定原生質(zhì)體活力。 如形態(tài)上完整，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體即為存活的。 2、染色識(shí)別A: FDA法

69、： FDA本身沒(méi)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被脂酶分解為具熒光的極性物，不能透過(guò)質(zhì)膜，而是留在細(xì)胞內(nèi)發(fā)光。B:其他染色方法,,FDA法,,2.13.5 原生質(zhì)體培養(yǎng)方法1、液體淺層培養(yǎng)將含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進(jìn)行培養(yǎng)。一般直徑3cm加1-1.5ml培養(yǎng)液，6cm加2-3ml,5-10天后開(kāi)始原生質(zhì)體分裂優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，原生質(zhì)體代謝物易擴(kuò)散，防止有害物質(zhì)積累過(guò)多造成毒害，易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。 缺點(diǎn)：是原