細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程

1、1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)1.1培養(yǎng)基的配置：⑴將一袋培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水（水溫20℃～30℃）到950毫升，輕微攪拌溶解。⑵加入2.438克碳酸氫鈉。⑶輕微攪拌溶解，加注射用水至1升。⑷用1molL氫氧化鈉溶液或1molL鹽酸溶液調(diào)pH至6.86.9。⑸用0.2μm濾膜正壓過(guò)濾除菌。⑹溶液應(yīng)在2℃－8℃下避光保存。1.2胎牛血清的處理：胎牛血清的處理：沒(méi)有滅活的血清中含有補(bǔ)體成分，需

2、要將血清在60℃條件下滅活30min。在水浴鍋內(nèi)進(jìn)行，滅活的過(guò)程中，要不停的搖晃，是受熱均勻，防止沉淀析出來(lái)。滅活后的胎牛血清最好分裝后放置20℃，分裝的目的是為了防止血清的反復(fù)凍融。1.3CHO的復(fù)蘇的復(fù)蘇1.3.1預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。1.3.2取保存的安倍瓶迅速加入37度水浴鍋中，不斷搖動(dòng)，保證1min內(nèi)解凍。1.3.3在超凈臺(tái)中加入37度預(yù)熱的DNEN8mL至離心

3、管中，同時(shí)加入細(xì)胞冷凍液，800rpm離心5min。13.4棄上清加入37度預(yù)熱的DMEM和10%的太牛血清37度5%二氧化碳培養(yǎng)箱中過(guò)夜。1.4CHO細(xì)胞換液細(xì)胞換液（復(fù)蘇后的細(xì)胞，一般是在4小時(shí)或是18小時(shí)左右對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行換液）1.4.1預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。1.4.2取出細(xì)胞培養(yǎng)板，用移液器吸出平板內(nèi)的培養(yǎng)基，用PBS或是培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，注意清洗時(shí)把清洗液緩緩延平板邊

4、緣流進(jìn)，防止用力過(guò)大吹起細(xì)胞。1.4.3加入培養(yǎng)基9ml，加1ml的胎牛血清。1.4.437度5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。1.5CHO細(xì)胞細(xì)胞的傳代細(xì)胞細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累（可見(jiàn)到培養(yǎng)液變黃），而且細(xì)胞的生長(zhǎng)空間也受到限制，就會(huì)影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存。這時(shí)就需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過(guò)程就叫做傳代。1)懸浮細(xì)胞的傳代懸浮細(xì)胞可以直接將培養(yǎng)瓶中的液體吸掉，只留下少量

5、，然后加入新鮮培養(yǎng)液即可。當(dāng)細(xì)胞懸液中碎片或顆粒物較多，感覺(jué)到比較臟時(shí)，可以將懸液移到離心管內(nèi)，800rpm離心5分鐘，棄上清，加入約2ml培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加23滴至已加入新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（擰松培養(yǎng)瓶蓋）。2)貼壁細(xì)胞的傳代(1)將消化液（胰酶）從冰箱中拿出，放在室溫條件下預(yù)熱；(2)吸出全部培養(yǎng)液，沿壁緩緩加入消化液，將培養(yǎng)瓶有細(xì)胞面向下，加入消化液的量至剛好可以覆蓋為止約1ml，輕輕搖晃；(3

6、)置于37℃消化2min左右，其間在顯微鏡下觀察，消化至細(xì)胞收縮變圓、部分脫落即可停止消化（加入血清即可停止消化），以防消化過(guò)度；(4)加入兩到三吸管含血清的培養(yǎng)液，終止消化；用吸管輕輕吹洗培養(yǎng)瓶有細(xì)胞的一面，以使細(xì)胞脫落干凈；(5)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，800rpm離心5分鐘；棄上清，加入培養(yǎng)液，吹打至均勻，滴加23滴至已加入新鮮培養(yǎng)液（約8ml）的培養(yǎng)皿中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代的盤數(shù)根據(jù)細(xì)胞的數(shù)目確定，一般在34盤，傳代

7、后的數(shù)目約為104。1.6細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)在操作臺(tái)上取一定量經(jīng)離心過(guò)混合均勻的細(xì)胞溶液（約0.5ml）放到小的滅過(guò)菌的板上，取出離開操作臺(tái)后加入一定體積的0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染色，取染色好的細(xì)胞培養(yǎng)液慢慢加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，要防止計(jì)數(shù)板上有空隙，然后在顯微鏡下數(shù)出細(xì)胞的數(shù)。（一般取對(duì)角的四個(gè)大格或中間的方格然后去平均值104）。1.7.細(xì)胞的凍存細(xì)胞的凍存細(xì)胞凍存的原則是要逐步緩慢降溫，以避免細(xì)胞內(nèi)部形成冰晶對(duì)細(xì)胞造成傷害。1)貼壁細(xì)胞經(jīng)消

8、化、離心收集，懸浮細(xì)胞經(jīng)離心收集；2)大約106個(gè)細(xì)胞加入1ml凍存液（細(xì)胞培養(yǎng)液和10%DMSO），用吸管吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液；3)加入到凍存管中。如用1.8ml的凍存管，每管最好不要加入超過(guò)1.5ml的細(xì)胞懸液；4)在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞名稱及凍存日期；5)用厚布或衛(wèi)生紙包裹凍存管，置于4℃半小時(shí)，然后置于20℃兩小時(shí)，再置于40℃兩小時(shí)，然后置于液氮上方過(guò)夜；第二天將細(xì)胞置于液氮中；如果僅想提取細(xì)胞內(nèi)的東西可以直接放在20度的