細胞培養(yǎng)技術cellculturetechnique

1、第二講 正常和腫瘤組織細胞培養(yǎng),溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院陶志華,內 容,正常組織細胞培養(yǎng) 上皮細胞的體外培養(yǎng) 血管內皮細胞的體外培養(yǎng) 腎小管上皮細胞的培養(yǎng) 巨噬細胞的培養(yǎng) 淋巴細胞的培養(yǎng)腫瘤細胞培養(yǎng),上皮組織的體外培養(yǎng),上皮細胞的基本特征：,1.上皮組織的形態(tài)結構 群體依賴性（population dependence)

2、 接觸抑制（contact inhibition) 2.上皮細胞的極性 貼壁依賴性細胞-貼壁生長 生長基質 3 . 上皮細胞間的連接,體外培養(yǎng)的上皮組織細胞的生長生物學,1. 形態(tài)學結構： 均質性、透明性很強，結構不明顯,2. 體外培養(yǎng)上皮組織的生長與增殖特征,(1) 體外培養(yǎng)的特殊條件

3、： a. 防范微生物污染 b. 生長基質的基質 c. 特殊的培養(yǎng)基 M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 無血清培養(yǎng)基 d. 去成纖維細胞,(2) 體外培養(yǎng)上皮細胞的形態(tài)學變化,(3) 體外培養(yǎng)上皮細胞的生存狀態(tài),體內：機體自身神經和內分泌因素 體外：促細胞增殖

4、因子和促細胞分化因子,細胞增殖態(tài)細胞分化態(tài),體外培養(yǎng)上皮組織細胞的觀察與檢測,1. 一般形態(tài)學觀察 光鏡： 形態(tài)、輪廓、生長情況等。 細胞規(guī)則、明亮而飽滿、細胞輪廓不清 電鏡： 橋粒、形態(tài)結構特征、細胞間關系培養(yǎng)液pH變化：

5、 顏色變化？培養(yǎng)物的污染情況： 透明度變化？,2. 組織化學與免疫組織化學觀察與檢測酶類： 堿性磷酸酶 琥珀酸脫氫酶特異性抗原標記物： 角蛋白、上皮細胞膜抗原

6、 VIII因子、晶體蛋白、唾液酸糖蛋白,血管內皮細胞的體外培養(yǎng),人臍靜脈內皮細胞的培養(yǎng),組織來源： 嬰兒臍帶培養(yǎng)用液： M199+20%FCS D-Hanks 0.1%膠原酶溶液培養(yǎng)用具：,1.主要材料：,2.培養(yǎng)方法：,分離細胞培養(yǎng)法,(1) 關于接種材料的制備 取材與消化

7、 消化酶、濃度、時間 (2) 排除成纖維細胞 傳代去除法 加肝素培養(yǎng)法(90u/ml) 刮除法 (3) 關于培養(yǎng)液 (4) 關于傳代培養(yǎng),5.討論：,(1) 光鏡檢查 (2) 透射電鏡檢查： W-P小體 (3) V

8、III因子相關抗原的免疫組化檢測,6. 內皮細胞的鑒定：,腎小管上皮細胞的培養(yǎng),1. 主要材料： a. 細胞來源： b. 無血清培養(yǎng)液： 基礎培養(yǎng)液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物：

9、 胰島素 5?g/ml 轉鐵蛋白5 ? g/ml 硒 5 ? g/ml 氫化可的松36ng/ml

10、 T3 4 ng/ml EGF 10 ? g/ml,c. 消化液： 0.2%胰蛋白酶d. 細胞篩網： 80和100目,2.原代培養(yǎng)：

11、切取1cm3外層腎皮質、剪碎成1mm3 80目研磨沖洗、于100目上收集腎小管節(jié)段0.2%胰蛋白酶消化、調整細胞數(shù)接種于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶進行培養(yǎng)每隔3~4天，更換培養(yǎng)液,,,,,3.傳代培養(yǎng)：4. 培養(yǎng)結果： 3d 長出細胞 5~7d 進入對數(shù)生長期 7~9d

12、 融合成單細胞層5.鑒定： 抗角蛋白抗體染色（+）,6.注意事項：,a. 分離方法：b. 鑒定方法：,巨噬細胞的培養(yǎng),巨噬細胞的培養(yǎng),動物： 小鼠、大鼠、兔、人培養(yǎng)基： Eagle MEM RPMI164

13、0 HamF12常用的巨噬細胞： 肺泡和腹腔巨噬細胞,獲取巨噬細胞的方法,（一）肺泡巨噬細胞 支氣管肺泡灌洗法 支氣管鏡肺泡灌洗法（二）腹腔巨噬細胞 1. 小鼠腹腔巨噬細胞的獲?。?(1)主要材料：

14、 實驗動物: 6周齡小鼠 培養(yǎng)液： 10%FCS RPMI1640,巨噬細胞的純化,1、原理： 巨噬細胞黏附能力強、貼壁快特點 貼附培養(yǎng)時間 貼附培養(yǎng)溫度2. 方法： 常規(guī)差速黏附處理：

15、 低溫差速黏附處理：,巨噬細胞的接種和培養(yǎng),（一）主要材料： 培養(yǎng)液： RPMI1640 等+10~40%FCS+抗生素 （二）實驗步驟： a. 冷分離 b. 調整細胞濃度：2~4×106/ml c. 接種培養(yǎng),（三）培養(yǎng)結果：,大 小：

16、20~50?m形 態(tài)： 菱形、星形、圓形功 能： 吞噬功能增殖情況： 不增殖、存活1~3周,（四）巨噬細胞的鑒定1. 吞噬實驗： 加入0.001M(final con.)SiO2 吞噬泡2. 抗胰蛋白酶消化能力試驗： 0.25%胰蛋白酶消化20min、再用吸管反復吹打

17、 細胞變園但不脫落3. 細胞化學試驗： ACP酶染色：棕黑色 NSE酶染色：紫藍色,淋巴細胞的培養(yǎng),各類淋巴細胞的主要特征,表面標志： 1.表面受體： TCR SRBC R

18、 Fc R MR Measles viruse R,T淋巴細胞：,MHC CD,2. 表面抗原,B淋巴細胞,1. 表面受體 BCR FcR CR

19、 絲裂原受體 EBV R2. 表面抗原 MHC抗原 CD抗原（CD19、20、 21、23、45）,血淋巴細胞的分離,（一）單個核細胞的分離,密度梯度離心法,（二）純淋巴細胞的制備,1. 玻璃黏附法2. 羰基鐵粉法,（三）T、B淋巴細胞的分離,1. T細胞花環(huán)沉降法2. 尼龍毛柱分離法,（四）大顆粒

20、淋巴細胞的分離,（五）FACS儀分離（六）免疫磁珠法,三、血淋巴細胞的體外培養(yǎng)應用,（一）淋巴細胞轉化試驗,（二）B細胞產生Ig的檢查,（三）T細胞介導的細胞毒試驗,（四）NK細胞毒性試驗,（五）K細胞毒性試驗,（六）LAK細胞的制備,（七）TIL細胞的制備,（八）淋巴細胞的體外長期培養(yǎng),1. 用IL-2建立T淋巴細胞克隆2. 用EB病毒轉化B淋巴細胞3. 用B細胞生長因子建立B淋巴細胞株,腫瘤細胞體外培養(yǎng),腫瘤細胞在體外的

21、生長生物學特性,1、腫瘤細胞永生性的保持2、形態(tài)學變化3、細胞具有更高的增殖能力4、細胞表面形狀的改變5、接觸抑制減弱或消失6、懸浮生長特性7、成瘤性的特性,RPMI1640+10~20%FCS+0.03%谷氨酰胺： 上皮性癌細胞或懸浮性腫瘤細胞DMEM、199、MEM： 肉瘤細胞的培養(yǎng)F12、L-15: 上皮性癌細胞的培養(yǎng)（如肝癌細胞）

22、加: 2 g/L NaHCO3 20 mmol/L HEPES,腫瘤細胞體外培養(yǎng)常用的培養(yǎng)基,（一）培養(yǎng)液的種類和選擇,（二）培養(yǎng)液特殊添加劑,常用的促細胞生長因子及使用的終濃度 添加劑 終濃度 BSA 10-5 mol/ml TRF

23、 5~10 ug/ml Insulin 5 ug/ml 氫化可的松 10-6mol/ml EGF 5 ng/ml FGF

24、 5 ng/ml NGF 5 ng/ml,,,,腫瘤組織細胞的原代培養(yǎng)（一）取材 轉移癌標本？ 原發(fā)癌標本？,激光捕獲顯微切割技術 Laser Captur

25、e Microdissection，LCM,組織形態(tài)學： 識別目的細胞成功捕獲細胞目的分子的完整性,原 理,目的細胞獲取：,（二）植塊培養(yǎng)法 建立細胞培養(yǎng)檔案： 病理切片、免疫組化、HE染色。 步 驟：,（

26、三）分散細胞培養(yǎng)法 1、組織細胞分離： 機械分散法 膠原酶分散法 2、 接種密度： 1×106/ml

27、 4~5ml/25cm2培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶,（四）含腫瘤細胞的體液培養(yǎng)法 (五）原代培養(yǎng)的一般結果：,成纖維細胞的生長淋巴細胞巨噬細胞上皮性癌細胞植塊周邊的細胞細胞間隙,1、刮除法2、差速黏附法3、酶消化法4、磁珠法細胞分選,（六）去除成纖維細胞的方法,1、不同培養(yǎng)方法的生長情況2、傳代：3、原代培養(yǎng)過程中避免污染和耐心操作,（七）注意事項：,二、腫瘤細胞的傳代,（一） 首次傳代（二）繼續(xù)傳代,腫瘤細胞的克隆

28、培養(yǎng)法,1、集落克隆法： a. 不銹鋼圈法 b. 濾紙法 c. 吸管吹打法2. 單個細胞克隆培養(yǎng)法 a. 有限稀釋法 b. 毛細管分離法 c. 蓋玻片法,腫瘤細胞體外生長的形態(tài)學與細胞學特征,1、 形態(tài)學特征：

29、 2、腫瘤細胞生長曲線和倍增時間,腫瘤細胞的核型和異常生長特性,1. 染色體數(shù)目及核型2. 永生性3. 異質性4. 動物接種成瘤性,細胞系的鑒定,（一）細胞系鑒定的內容：,1、鑒定細胞系的純度2、細胞系的穩(wěn)定性3、細胞學特征4、微生物污染檢測5、染色體穩(wěn)定性6、有無細胞系（株）交叉污染,（四）細胞系的同工酶譜分析,1、用途： a、種屬來源 b、細胞特征的指

30、標 c、惡化程度的指標 d、檢測細胞系有無交叉污染 LDH G6PD NP,動力學法 電泳區(qū)分法層析法電聚焦分離法免疫法,2、檢測方法：,已建立細胞的鑒定、管理和使用,組織起源和已傳代數(shù)凍存液細胞活力培養(yǎng)液：培養(yǎng)基、血清、抗生素等溶解后細胞生長特征接種存活率細胞形態(tài),腫瘤細胞培養(yǎng)的應用,

31、一、腫瘤細胞對組織浸潤的體外研究二、人惡性腫瘤細胞的動物移植瘤研究三、腫瘤細胞的體外分化實驗四、培養(yǎng)腫瘤細胞的凋亡誘導研究五、腫瘤細胞的體外化療藥物敏感性實驗六、腫瘤發(fā)病機制研究,基本思路：,腫瘤組織,腫瘤癌旁組織和正常組織,基因差異表達分析,腫瘤相關基因,基因功能研究,基因定量檢測研究,腫瘤治療靶點,腫瘤早期診斷和治療監(jiān)測,,,,,,,SiRNA技術,基因芯片技術SAGE技術（cDNA miRNA）,,,標本處理？,

32、,基因芯片,固相芯片液相芯片,miRNA芯片 cDNA芯片甲基化芯片,,液相芯片技術,實時熒光PCR技術微量反應體系ABI 7900,TaqMan® MicroRNA Arrays,,SAGE技術（serial analysis of gene expression),SAGE的原理,miRNA 檢測技術與應用,microRNA研究現(xiàn)狀,小RNA研究—Hot topics in the world,2000年

33、，RNAi的研究進展被Science雜志評為重大科技突破。2001年，RNAi作為當年最重要的科學研究成果之一，再次入選“十大科技突破”。2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA & RNAi”評為2002年度最耀眼的明星。同時，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。2003年，microRNA的研究第四次入選“十大科技突破”，排在第四位。2005年，microRNA的研

34、究第五次入選“十大科技突破”。RNA研究的突破性進展，是生物醫(yī)學研究領域近20年來，可與HGP相提并論的最重大成果之一。,miRNA的產生與功能,1.在細胞核內轉錄成前體轉錄本miRNA2.被RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成約70- 90nt的發(fā)夾狀pre-miRNA3.轉運到細胞質被Dicer加工成成熟miRNA4.雙鏈miRNA分子被解鏈，單鏈的miRNA 進入一個核糖蛋白復合體miRNP(RISC)

35、5.通過與靶基因的3’ UTR 區(qū)互補配對，指導 miRNP復合體對靶基因mRNA 進行切割 或者翻譯抑制,microRNA,成熟的MicroRNA(miRNA)是一種22個 nt左右的內源性單鏈小分子RNA由帶莖環(huán)結構的雙鏈RNA前體剪切而成具有高度保守性、時序性和組織特異性通過與特異mRNA結合，抑制目標基因表達或降解mRNA調節(jié)人類三分之一的基因,miRNA在動物與植物中的功能,（1）發(fā)育

36、 Timing (Lee et al. 1993) Cell proliferation (Brennecke et al. 2003) Stem cell & neuron (Krichevsky et al. 2003; Hatfield et al., 2005)（2）細胞死亡(Baehrecke, 2003) （3）疾病 腫瘤(Lu

37、 et al. 2005) 原癌miRNA(He et al. 2005) 腦腫瘤(Ciafre et al. 2005; Chan et al. 2005) 白血病(Calin et al. 2002; 2004) 糖尿病(Poy et al. 2004) （4）膽固醇的生物合成(Krutzfeldt et al. 2

38、005)（5）DNA 甲基化與染色質修飾(Bao et al. 2004),,miRNA檢測的技術挑戰(zhàn),Northern Blot (雜交法)常規(guī)方法，易于操作需大量樣品(ug級)動力學范圍低（約2個數(shù)量級）錯配雜交問題，難以區(qū)分通常只有很少序列差別的序列Microarrays (芯片法)通量高可測動力學范圍較寬需大量RNA樣品，約5μg per array 很難區(qū)分前體miRNA和成熟miRNA對類似結構的miR

39、NA分辨率差Quantitative Real-Time PCR(實時定量PCR)只需微量樣品非常寬的動力學范圍（7 log）高靈敏度, 高特異性,SiRNA干擾技術Small interference RNA,SiRNA技術概況,何謂 SiRNA Small interference RNA,中心法則,首先把外源的dsRNA導入細胞中，在細胞中，該dsRNA 被Dicer切割為21～23nt的小分子干擾核糖核酸（siR

40、NA），切割后的siRNA，然后結合到核糖核酸酶復合物上形成RNA誘導的基因沉默復合體（RISC），該復合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC。活化的RISC通過由siRNA決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉錄體，轉錄體被降解掉，最終導致目的基因沉默效應。,,思考題,細胞培養(yǎng)的基本條件？體外細胞培養(yǎng)方法學和細胞生長生物學？舉一個例子，闡述上皮細胞體外培養(yǎng)技術和流程。腫瘤細胞體外培養(yǎng)技術及臨床應