懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)講義

1、懸浮細(xì)胞傳代及細(xì)胞計(jì)數(shù)懸浮細(xì)胞傳代及細(xì)胞計(jì)數(shù)一、一、細(xì)胞傳代細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諔腋〖?xì)胞傳代技術(shù)。進(jìn)一步掌握細(xì)胞培養(yǎng)的操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：培養(yǎng)細(xì)胞生長一定時間后，需分離再培養(yǎng)，否則細(xì)胞因生存空間不夠，細(xì)胞密度過大，致營養(yǎng)不足而引起細(xì)胞衰老、停止生長甚至死亡。為了維持細(xì)胞的存活和生長，必須進(jìn)行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用品：實(shí)驗(yàn)用品：（一）儀器凈化工作臺、離心機(jī)、恒溫水浴

2、箱、冰箱（4℃、20℃、70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；（二）玻璃器皿吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、廢液缸、（三）塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架（四）其他物品微量加樣槍、計(jì)數(shù)板、記號筆、移液槍（五）試劑1640培養(yǎng)液、PBS操作步驟：操作步驟：1.準(zhǔn)備：打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。2.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度

3、。3.首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS，放入培養(yǎng)板孔中，輕輕吹打孔壁，inhibition)。而惡性腫瘤細(xì)胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（piledup）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細(xì)

4、胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（DensityInhibition）。（3）停滯期(Stagnatephase)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時進(jìn)行傳代，細(xì)胞就會停止增殖，進(jìn)入停止期。此時細(xì)胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateauphase）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會脫落，嚴(yán)重的會發(fā)生死

5、亡，因此，應(yīng)及時傳代。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?.能獨(dú)立的進(jìn)行細(xì)胞技術(shù)，會繪制生長曲線，了解細(xì)胞生長的發(fā)育特性。2.學(xué)習(xí)在科研中如何應(yīng)用生長曲線實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)原理：生長曲線的測定（計(jì)數(shù)法）是測定細(xì)胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過長短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個過程中的細(xì)胞數(shù)目的

6、動態(tài)變化，需連續(xù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通常計(jì)數(shù)7天。為精確起見，一般每次計(jì)數(shù)三瓶細(xì)胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細(xì)胞數(shù)對培養(yǎng)時間做圖，即生長曲線。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細(xì)胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1312處加藥。細(xì)胞技術(shù)的時間和次數(shù)依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。另外，測定生長曲線的常用方法還有MTT法。計(jì)數(shù)板原理：計(jì)數(shù)板原理：當(dāng)待測細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中