組會(huì)匯報(bào)多殺菌素高產(chǎn)菌株發(fā)酵方面研究現(xiàn)狀匯報(bào)人

1、組會(huì)匯報(bào),多殺菌素高產(chǎn)菌株發(fā)酵方面研究現(xiàn)狀匯報(bào)人：王美玲指導(dǎo)導(dǎo)師：盧文玉-,多殺菌素類(lèi)化合物是由刺糖多孢菌經(jīng)有氧發(fā)酵后的次級(jí)代謝產(chǎn)物。本質(zhì)上屬大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，且沒(méi)有抑菌活性。純多殺菌素包含6種成分，其中組分A和D的活性最高。 刺糖多孢菌的培養(yǎng)溫度約為24-32℃，而產(chǎn)素的最適溫度為28-30℃。大規(guī)模發(fā)酵時(shí)應(yīng)通過(guò)通氣量和攪拌速度來(lái)維持罐內(nèi)溶解氧在60％以上，最好為65％以上。罐內(nèi)壓力為0.034Mpa,,,,,,

2、,,,1、誘變突變株：菌絲誘變、萌發(fā)孢子誘變： 單一誘變和復(fù)合誘變2、抗性突變株：多殺菌素抗性突變株：（雙層培養(yǎng)法篩選）鼠李糖（初級(jí)代謝終產(chǎn)物、前體）3、耐代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物突變株：慶大霉素、紅霉素、安普霉素4、誘變和抗性結(jié)合（多重迭代）5、耐C源分解代謝物阻遏突變　　　2-脫氧-D-葡萄糖6、原生質(zhì)體融合技術(shù),誘變劑,無(wú)論化學(xué)誘變劑還是物理誘變劑，單獨(dú)使用很少能收到預(yù)期的效果。所以生產(chǎn)中多采用幾種誘變劑復(fù)合

3、處理、交叉使用的方法UV 和氯化鋰(LiCl)復(fù)合誘變，硫酸二乙酯( D E S ) 誘變，亞硝基胍（N T G） 誘變，D E S和LiCl 復(fù)合誘變，60Co g 及137Cs g 誘變 、微波誘變、ＭＮＮＧLiCl 本身無(wú)誘變作用,原生質(zhì)體制備條件和再生研究（1）菌絲生長(zhǎng)曲線(xiàn)（對(duì)數(shù)中期）（2）Gly對(duì)再生的影響（干擾細(xì)胞壁的形成）（3）溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶濃度、作用時(shí)間、溫度的影響（滲透壓、穩(wěn)定劑，Nacl、蔗糖）

4、（4）原生質(zhì)體的滅活（熱、紫外）（5）融合：（種間和種內(nèi)，與紅色糖多孢菌？）（不同分子量和濃度PEG、電融合）（6）再生培養(yǎng)基的選擇（瓊脂濃度）,培養(yǎng)基的優(yōu)化（發(fā)酵和種子培養(yǎng)基）,（1）單一C（N）源、復(fù)合C（N）源、有（無(wú)）機(jī)氮源、微量元素、均與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、正交試驗(yàn)（2）響應(yīng)曲面法單因素試驗(yàn) P-B試驗(yàn) SAS軟件分析 顯著因素 中心組合設(shè)計(jì) 響應(yīng)面回歸分析 三維圖 最優(yōu)方案（3）研究C/N比對(duì)菌絲形態(tài)

5、和產(chǎn)量的影響（紅霉素）（4）搜集劑（磷鈣、沸石）對(duì)產(chǎn)量和PH影響 （銨離子）,,發(fā)酵條件優(yōu)化,1、種子液的影響接種量、種齡2、搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵周期的確定消前pH、搖瓶轉(zhuǎn)速以及搖瓶裝量進(jìn)行正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 變溫（4/5d）對(duì)產(chǎn)素的影響 (不)加玻璃珠對(duì)生物量和產(chǎn)量的影響3、初始濃度葡萄糖、磷酸鹽對(duì)菌體和產(chǎn)量的影響，磷酸鹽對(duì)葡萄糖的利用的影響葡萄糖效應(yīng)：補(bǔ)糖時(shí)間的確定（流加）4、補(bǔ)加前體物質(zhì)的影響：加入時(shí)間和量,5

6、、接種方式的影響：種子（挖塊、菌絲、孢子）、發(fā)酵（一級(jí)和二級(jí)種子）（阿維霉素）6、短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸等）作為緩效碳源加入時(shí)間的確定及影響7、DO、OUR、CER、RQ的相關(guān)分析8、硝酸銨（促進(jìn)生長(zhǎng)，降低產(chǎn)量）、磷酸二氫鉀（調(diào)節(jié)PH，ATP、磷酸酶）、正丙醇的影響9、混合脂肪酸代替豆油 （螺旋霉素）10、流加補(bǔ)料的時(shí)間、速率， 分批補(bǔ)料,,初篩(菌塊—TLC法),步驟：涂布 培養(yǎng) 浸提 點(diǎn)樣 層析 顯色

7、 比較（1、原理：斑點(diǎn)的有無(wú)和深淺（2、驗(yàn)證顏色的深淺與濃度相關(guān)（即可行性）（3、展開(kāi)劑的選擇（甲醇/丙酮）（4、檢測(cè)最低濃度、檢測(cè)范圍的確定（5、瓊脂塊的大小的確定設(shè)想：如果培養(yǎng)基中含有在含脂肪，以中性紅為檢測(cè)劑，測(cè)定脂肪酶的活性（產(chǎn)量和顏色成正比）,,,,,,,,,,復(fù)篩(HPLC法),發(fā)酵液的預(yù)處理：（油的多少）發(fā)酵液 離心 棄上清 浸提 離心 微孔濾膜過(guò)濾 HPLC根據(jù)分離度、拖尾因子確定：流動(dòng)相、流速、進(jìn)液

8、量，檢測(cè)波長(zhǎng)。,,,,,,,,,,,,,,前體的推測(cè)研究,根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)青霉素為例：（聚酮反應(yīng)）分支氨基酸和植物油分解產(chǎn)生短鏈脂肪酸（1）Asp、Gly、Met、Leu、Val是丙酰CoA的來(lái)源。異丁酸、丙酸、乙醇、甲醇、異丙醇、正丙醇、乙酸銨、丙酸鈉、丁酸鈉、檸檬酸鈉形成乙酰CoA、甲基丙二酰CoA、丙酰CoA等前體（2）最佳前體不同濃度和補(bǔ)加時(shí)間、補(bǔ)加方式的影響,提取條件的優(yōu)化：,單一溶媒（甲醇、丙酮、乙腈等）混合溶媒提取

9、（乙酸乙酯的作用）提取時(shí)間提取方法（超聲波、靜置）萃取次數(shù)被提物的選擇?。òl(fā)酵液、菌體）,高產(chǎn)菌株生理特性的描述,菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、遺傳穩(wěn)定性、生化特性：生物量的測(cè)定：干重法，測(cè)核酸　還原糖的測(cè)定：DNS法可溶性氨基氮的測(cè)定：甲醛法/納氏試劑分光光度法磷酸鹽的測(cè)定：氯化亞錫分光光度法酸價(jià)的測(cè)定：游離脂肪酸的含量效價(jià)、ＰＨ及其他系數(shù)的測(cè)定成分Ａ、Ｄ比重,植物油在大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素中應(yīng)用,（1）疏水性作為緩效碳源避免

10、葡萄糖效應(yīng)（2）為短鏈脂肪酸的來(lái)源，為聚酮類(lèi)提供前體（3）分解為脂肪酸和甘油分別經(jīng)β-氧化，EMP途徑合成乙酰輔酶A （4）消泡劑（5）避免使用黃豆餅粉，粘度大，產(chǎn)泡多（6）過(guò)量產(chǎn)生脂肪酸使PH下降（7）磷酸鎂的影響？（8）穩(wěn)定劑對(duì)油的利用（9）甲基丙二酰CoA羧基轉(zhuǎn)移酶、檸檬酸脫氫酶、脂肪酶活性大?。?0）脂肪酸種類(lèi)、飽和程度、添加量和時(shí)間的影響,分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué),測(cè)定生物量、培養(yǎng)液PH、葡萄糖消長(zhǎng)、效價(jià)的變化趨勢(shì)利