肉雞脂質(zhì)代謝相關(guān)機(jī)制探索

1、胰島素抵抗專(zhuān)題 —讀書(shū)報(bào)告,報(bào)告人 ：韓春艷導(dǎo) 師：李 垚 教授 2016年9月,目 錄,1,胰島素抵抗概述,定義,胰島素抵抗 ( Insulin resistance ，IR)是指胰島素的外周靶組織對(duì)內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低，導(dǎo)致生理劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常的生理效應(yīng)，即要超過(guò)正常量的胰島素才能維持血糖的穩(wěn)定。,,1. 胰島素抵抗概述,

2、,肝臟,肌肉,脂肪,胰島素典型的效應(yīng)器官,,肝臟,肌肉,脂肪,優(yōu)于其它靶組織首先發(fā)生胰島素抵抗,最重要的靶組織,對(duì)胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展起重要作用,,高尿酸血癥,如何緩解胰島素抵抗、提高胰島素的敏感性己成為防治2型糖尿病、肥胖、高血糖癥等疾病的重要課題。,,2.1 PI3K/PKB 胰島素信號(hào)通路與胰島素抵抗,PI3K/PKB 胰島素信號(hào)通路,MAPK胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,胰島素信號(hào)通路,PI3K/PKB 胰島素信號(hào)通路,2.2 P

3、I3K/PKB 通路關(guān)鍵基因—IR,胰島素受體（insulin receptor, IR）是由2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基通過(guò)二硫鍵聯(lián)接組成且高度糖基化的跨膜四聚體蛋白。,IR結(jié)構(gòu),IR功能,,IRS結(jié)構(gòu),胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS) 是指能夠被激活的胰島素受體酪氨酸激酶作用的底物， 其上具有十幾個(gè)酪氨酸殘基，可被磷酸化。,PI3K/PKB 通路關(guān)鍵基因—IRS,,對(duì)傳入的信號(hào)進(jìn)行整合、放大,

4、IRS功能,活化的 IRS作為“停泊蛋白”發(fā)揮作用，與數(shù)種含有 SH2 結(jié)構(gòu)域的適配蛋白聚合，如PI3K，使得這些適配蛋白被活化。,通過(guò)cDNA克隆篩選到的編碼SH結(jié)構(gòu)域的基因的蛋白產(chǎn)物,廣泛表達(dá)于胰島素的敏感組織中，如肌肉、脂肪、肝臟、胰島等,PI3K結(jié)構(gòu),PI3K/PKB 通路關(guān)鍵基因—PI3K,磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphatidy linosito l 3-kinase，PI3K）是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，包含 1 個(gè) p

5、110催化亞基和 1 個(gè) p85調(diào)節(jié)亞基。,PI3K功能,其中p85調(diào)節(jié)亞基含有兩個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，可以與磷酸化的IRS配合，將p110催化亞基轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上，激活 PI3K，進(jìn)一步將胰島素信號(hào)向下傳遞。,PI3K/PKB 通路關(guān)鍵基因—PKB,PKB，也稱(chēng)作 Akt，是一種絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶，位于 PI3K 的下游，作為PI3K/PKB 胰島素信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)蛋白，參與調(diào)節(jié)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和糖原的合成。,PKB概念,。,PI3K

6、/PKB 通路關(guān)鍵基因—PKB,,。,糖原合成酶激酶3（glycogen synthesis kinase，GSK-3），是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有酪氨酸磷酸化激酶的活性，參與細(xì)胞增殖和調(diào)亡、細(xì)胞遷移、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞內(nèi)的代謝調(diào)控。 GSK-3 分為 GSK-3α 和 GSK-3β 兩種亞型，其中 GSK-3β 在糖原的合成與分解過(guò)程中起到調(diào)控作用。,PI3K/PKB 通路關(guān)鍵基因—GSK3,GSK-

7、3概念,GSK-3功能,脂肪細(xì)胞因子是由白色脂肪分泌的一類(lèi)蛋白類(lèi)物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)多項(xiàng)生理代謝過(guò)程。越來(lái)越多的研究證明，脂肪細(xì)胞因子對(duì)胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。,常見(jiàn)脂肪細(xì)胞因子,游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）是細(xì)胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和前列腺素合成的供體，為脂肪代謝的中間產(chǎn)物，是機(jī)體主要供給能量的來(lái)源。,3.1 游離脂肪酸（FFA）,,FFA導(dǎo)致IR的機(jī)制,FFA 抑制葡萄糖氧化,瘦素（Leptin）由肥胖基因（o

8、b基因）編碼產(chǎn)生，脂肪細(xì)胞分泌的分子量為16kDa的脂肪調(diào)節(jié)激素，是一種抗肥胖激素。,3.2 瘦素 （Leptin）,,瘦素導(dǎo)致IR的機(jī)制,抵抗素（Resistin）主要由白色脂肪組織分泌的一種富含半胱氨酸的多肽類(lèi)激素，因具有抵抗胰島素的作用而被命名，與胰島素抵抗呈正相關(guān)性。,3.3 抵抗素（Resistin）,,抵抗素導(dǎo)致IR的機(jī)制,抑制InR 及IRS-1分子中酪氨酸殘基磷酸化，使PI3K和PKB的激活減少，從而引起脂肪細(xì)胞的IR

9、,過(guò)度表達(dá)抵抗素的動(dòng)物體內(nèi)TG含量升高， HLD水平下調(diào)，F(xiàn)FA 水平增高，引發(fā)IR,3.4 腫瘤壞死因子-α（TNF-α）,腫瘤壞死因子-α（TNF-α）由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種跨膜蛋白，TNF-α 作為一種典型的前炎癥細(xì)胞因子，在胰島素抵抗個(gè)體中高表達(dá)。,,,TNF-α誘發(fā)和加重IR的機(jī)制,脂聯(lián)素（Adiponectin）是成熟脂肪組織特異性分泌的蛋白質(zhì)，具有與瘦素相似的抗糖尿病特性，主要表達(dá)于脂肪組織。在機(jī)體內(nèi)作為一種胰島素增敏激

10、素發(fā)揮作用，是與胰島素抵抗呈負(fù)相關(guān)性的脂肪細(xì)胞因子。,3.5 脂聯(lián)素（Adiponectin）,脂聯(lián)素抑制IR的機(jī)制,4,IR實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立,誘導(dǎo)型 （實(shí)驗(yàn)型）,4.1 高脂飲食誘發(fā)型,4.2 高糖飲食誘發(fā)型,,4.3 高糖高脂飲食誘發(fā)型,,4.4 飲食加藥物誘發(fā)型,4.5 藥物誘發(fā)型,槲皮素對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的高血糖肉雞的作用及機(jī)制,學(xué) 生：韓春艷導(dǎo) 師：李 垚 教授,目 錄,研究背景、目的及意義,技術(shù)路線(xiàn),,1,3

11、,試驗(yàn)方案,2,預(yù)期效果,4,5,試驗(yàn)進(jìn)程,槲皮素（Quercetin）是一種植源性黃酮類(lèi)化合物。 黃酮類(lèi)化合物可以改善血液循環(huán)，具有降低血糖、血脂和膽固醇的作用。具有調(diào)節(jié)畜禽脂質(zhì)代謝的生物學(xué)作用，多種黃酮類(lèi)化合物都能通過(guò)調(diào)節(jié)畜禽體內(nèi)脂肪沉積，改善胴體品質(zhì)。,1.1 研究背景,1.研究背景、目的及意義,,過(guò)量脂肪不僅降低了感官品質(zhì)，同時(shí)降低了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，不符合現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)、安全、低脂肉食品消費(fèi)的發(fā)展趨勢(shì)。,前期試驗(yàn)表明，黃酮類(lèi)化合物具

12、有降血脂、調(diào)節(jié)畜禽脂質(zhì)代謝等生物學(xué)作用；降低血清總膽固醇、甘油三酯水平以及肝組織中總膽固醇含量，并增加高密度脂蛋白含量，并且畜禽肉品質(zhì)得到良好改善；提示黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)畜禽體內(nèi)的脂肪沉積有一定影響，從而改善肉雞肉品質(zhì)。,STZ對(duì)機(jī)體組織毒性相對(duì)較小，動(dòng)物存活率高，是目國(guó)內(nèi)外使用較多的建立高血糖動(dòng)物模型的最佳藥物。,1.2 研究目的及意義 為了解肉雞脂質(zhì)代謝和肉品質(zhì)與血糖關(guān)系，我們通過(guò)建立高血糖肉雞模型，以探討血糖控制對(duì)血

13、脂變化的影響；并在飼糧中添加不同水平槲皮素進(jìn)行治療，通過(guò)檢測(cè)肌肉、脂肪和肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，來(lái)研究槲皮素能否或是如何通過(guò)降低血糖來(lái)影響脂質(zhì)代謝，從而改善肉品質(zhì)的。,2.技術(shù)路線(xiàn),,肉雞飼養(yǎng),空腹血糖（FPG）,生長(zhǎng)性能指標(biāo),肝組織化學(xué)染色檢測(cè),判斷合適的STZ注射劑量,2.技術(shù)路線(xiàn),3.試驗(yàn)方案,3.1 預(yù)試驗(yàn)3.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取1日齡健康、體重相近的AA肉仔雞120只，適應(yīng)一周后，隨機(jī)分為正常

14、對(duì)照組（n=30只）和造模Ⅰ、Ⅱ 、 Ⅲ組（n=30只），造模組設(shè)3個(gè)鏈脲佐菌素（STZ）劑量，分別為40、50、60mg/kg，每個(gè)劑量組30只肉雞 。,表3-1 預(yù)試驗(yàn)設(shè)計(jì),造模組肉雞禁食不禁水12h后，將STZ溶于0.1mol/L無(wú)菌檸檬酸緩沖液（pH=4.5）中，冰浴條件下配制成2%STZ溶液，立即經(jīng)腹部皮下快速注射（30min內(nèi)完成），正常對(duì)照組注射檸檬酸緩沖液。注射完成72h、1W、2W、3W、4W、5W、6W，每周每組隨

15、機(jī)選取6只肉雞翅靜脈采血，檢測(cè)空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）含量，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR），公式為HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5，來(lái)判斷高血糖模型是否成功。觀(guān)察血糖與用量的關(guān)系，確定合適注射劑量。,3.1.2 試驗(yàn)方法,3.2正式試驗(yàn)3.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取1日齡健康、體重相近的AA肉仔雞（公）520只，適應(yīng)一周

16、后（7日齡前自由采食和飲水），隨機(jī)分為8組，空白對(duì)照組、3水平槲皮素組和鏈脲佐菌素（STZ）組、STZ+3水平槲皮素組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，每組5只備用，試驗(yàn)期6周，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3-2。,表3-2 正式試驗(yàn)設(shè)計(jì),3.2.2 試驗(yàn)方法 空白組飼喂基礎(chǔ)日糧， 槲皮素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上添加0.02%、0.04%、0.06%槲皮素；所有STZ組肉雞在第7天適應(yīng)期結(jié)束后禁食不禁水12h，立即經(jīng)腹部皮

17、下快速 注射合適劑量的STZ；注射完成后72h以及每周每組隨機(jī)選取6只肉雞翅靜脈采血，檢測(cè)空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）含量，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，HOMA-IR），公式為HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5，來(lái)監(jiān)測(cè)血糖水平。注射一周后開(kāi)始飼喂不同劑量的槲皮素。,表3-3 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分,注：每kg飼糧中含：維生素A 1500 IU；維生素D 32

18、00 IU；維生素E 10IU；維生素K 0.5mg；維生素B12 0.01mg；生物素0.15mg；葉酸0.55mg；尼克酸30mg；泛酸10mg；吡哆醇3.5mg；核黃素3.6mg；硫胺素1.8mg；銅8mg；碘0.35mg；鐵80mg；錳60mg；硒0.15mg；鋅40mg。,3.2.3 試驗(yàn)日糧,,3.2.4 測(cè)定指標(biāo)及方法 (1)生長(zhǎng)性能指標(biāo)檢測(cè)：試驗(yàn)開(kāi)始后每天記錄采食量，每周進(jìn)行一次稱(chēng)重記錄，計(jì)算平均日增重

19、、平均日采食量以及料重比。 (2)屠宰性能指標(biāo)：正試試驗(yàn)開(kāi)始第1天和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)取2只雞進(jìn)行稱(chēng)重后屠宰，宰前停飼12h，分別計(jì)算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率、腹脂率、腿脂率。 (3)血液生化指標(biāo)：試驗(yàn)開(kāi)始第1天和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組每個(gè)重復(fù)取2只雞屠宰后取血樣10mL，分離血清后，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各項(xiàng)血液生化指標(biāo)。,(4)肉品質(zhì)：宰前停飼12h，每組每個(gè)重復(fù)取2只雞。

20、 肉色：屠宰2h內(nèi)0~4℃保存24h后測(cè)定胸肌、腿肌肉色。 滴水損失：屠宰分割后取胸肌、腿肌于４℃冰箱保存48ｈ后再稱(chēng)重，計(jì)算滴水損失率。 剪切力：屠宰后取腿肉股二頭肌和胸肌中段，在0~4℃條件下冷藏48h，取出后升溫15min，測(cè)定剪切力值。 pH值：屠宰后取胸肌，用胴體pH測(cè)定計(jì)測(cè)定pH45min和pH24h。 肌肉粗脂肪含量；屠宰后取胸肌和腿肌冷凍保存，

21、按常規(guī)方法測(cè)定粗脂肪含量。,(5)組織化學(xué)染色檢測(cè)：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，宰前停飼12h，每組每個(gè)重復(fù)取2只雞，采集肝臟，新鮮組織經(jīng)4%甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片及HE染色，光鏡下觀(guān)察組織結(jié)構(gòu)改變。 (6)分子指標(biāo)測(cè)定：試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，宰前停飼12h，每組每個(gè)重復(fù)取2只雞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western Blot法測(cè)定肌肉/脂肪、肝臟中各分子指標(biāo)mRNA及蛋白表達(dá)水平。,4.試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果,4.1 初步結(jié)果 試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)

22、肉仔雞的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異。 高血糖AA肉雞模型成功建立。4.2 預(yù)期效果 明確槲皮素對(duì)高血糖AA肉雞生長(zhǎng)性能、 屠宰性能、血液生化指標(biāo)及肉品質(zhì)的影響。 闡明槲皮素改善高血糖肉雞肉品質(zhì)的作用機(jī)制。,5.試驗(yàn)進(jìn)程,2014.12-2015.3 查閱文獻(xiàn)2015.3-2015.6 撰寫(xiě)開(kāi)題報(bào)告2015.7-2015.12 肉雞飼養(yǎng)試驗(yàn)2016.1-2016.12 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，數(shù)據(jù)