糖腎方改善C57BLKS-J db-db小鼠脂代謝紊亂的作用及相關機制研究.pdf

1、近年來，肥胖及其密切相關的代謝性疾病，包括非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、代謝綜合征(Metabolic syndrome，MS)和2型糖尿病等患病率日益攀升，嚴重危害全球人類的健康。NAFLD目前被認為是全球最普遍的慢性肝臟疾病，其在肥胖和糖尿病人群中的患病率顯著高于健康人群。此外，這些疾病會進一步導致動脈粥樣硬化、冠心?。–oronary heart disease

2、，CHD）等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。NAFLD最顯著的病理改變?yōu)楦闻K脂質尤其是甘油三酯（Triglyceride，TG）異常聚集在肝臟細胞造成脂毒性損傷肝細胞，影響肝功能。雖然目前脂質沉積的具體機制存有爭議，但脂質生成（脂肪酸從頭合成）、脂質的轉運和脂肪酸氧化等相關代謝途徑出現(xiàn)代謝紊亂必然造成肝臟脂質沉積。目前，針對NAFLD的臨床相關藥物如噻唑烷二酮類藥物和生活方式改善等在療效和安全性上不盡如人意;因此，利用我們的優(yōu)勢聚焦到開發(fā)中醫(yī)藥改

3、善血脂紊亂及保護肝臟脂肪變就顯得十分必要。
　　課題組李平教授在繼承前人經(jīng)驗和以多年臨床經(jīng)驗提出治療糖尿病腎病的重要組方糖腎方，并創(chuàng)新性提出了從肝論治糖尿病腎病理念;前期多中心臨床研究表明其可有效降低24 h尿蛋白和提高腎小球濾過率;但其對于糖尿病伴隨的脂代謝紊亂是否具有改善作用以及具體的分子機制是什么？基于上述背景知識，本研究主要利用NAFLD模型C57BLKS/J db/db小鼠，第一部分從整體動物實驗水平觀察糖腎方是否具有改

4、善脂代謝紊亂和保護肝脂變的作用;在此基礎上，第二部分圍繞脂質沉積開展糖腎方作用的具體機制研究:1）AMPK/SREBPs介導的脂質生成途徑;2）AMPK/Sirt1/PGC1α介導的脂肪酸β氧化代謝途徑;3）PI3K/Akt/mTOR信號通路及糖異生途徑;4）肝臟和白色脂肪組織巨噬細胞活化分型探索中藥糖腎方顆粒對db/db小鼠脂質代謝紊亂的調節(jié)尤其是肝臟脂肪變的潛在保護作用及相關機制。
　　目的:利用db/db小鼠觀察中藥糖腎方顆

5、粒對糖尿病伴隨的脂代謝紊亂調節(jié)和保護肝臟脂肪變的作用，并圍繞脂質沉積這一病理改變深入探討相關機制。
　　方法:8周齡雄性db/db和db/m小鼠隨機分成3組(n=9)，正常對照組(db/m)、模型組(db/db)、糖腎方組（db/db+TSF,2.4 g/kg/day），所有小鼠均以常規(guī)普通飼料喂養(yǎng)。順應性喂養(yǎng)2周后觀察基礎狀態(tài)并稱重，開始給予糖腎方干預，每周測量小鼠體重。糖腎方給藥干預12周后，禁食12h后眼內(nèi)眥取血，全自動生化

6、儀檢測血脂、血糖、血清游離脂肪等項目;處死小鼠，迅速分離小鼠肝臟、骨骼肌及白色脂肪等，用冷磷酸鹽緩沖液洗凈，濾紙吸干水分，稱重記錄，計算肝重指數(shù);一部分肝組織放入細胞凍存管中存入液氮備用，另一部分直接存入-80℃用于后續(xù)冰凍切片;其余放入中性福爾馬林溶液固定用于病理分析。骨骼肌及白色脂肪組織立即存入液氮中備用。
　　利用高效液相色譜方法建立的化學成分指紋譜圖全面評價中藥糖腎方顆粒的質量;H&E染色及油紅O染色觀察小鼠肝臟脂肪變及糖

7、腎方干預情況;利用Westernblot、Real-time PCR、IHC、免疫熒光及Confocal技術檢測糖腎方對各組小鼠肝組織中脂質生成途徑中pAMPK/SREBPs及下游靶基因表達的影響;利用以上方法檢測糖腎方對各組小鼠肝組織和骨骼肌中脂肪酸β氧化途徑中相關代謝酶的表達影響;利用以上方法檢測糖腎方對各組小鼠肝組織PI3K/Akt/mTOR信號通路及糖原合成的影響;利用Real-time-PCR、IHC檢測糖腎方對各組小鼠肝臟和

8、白色脂肪組織巨噬細胞的影響。
　　結果:1.糖腎方對db/db小鼠脂代謝調節(jié)及肝脂變保護作用:干預6周后，糖腎方可以顯著減輕db/db小鼠體重;干預12周即實驗終點時，其可顯著減輕db/db小鼠體重、肝重及肝重指數(shù);肝臟形態(tài)學表明db/m小鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，質地柔軟。db/db小鼠肝組織體積增大，有明顯腫脹感，色澤土黃，質地較硬，表面油膩感較顯著，提示該組小鼠肝臟脂肪變嚴重，而糖腎方干預可明顯改善以上病變;糖腎方可以顯著降

9、低小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C、FFA等因子水平，改善血脂水平和肝功能，但對血糖水平無顯著改善;H&E和油紅O染色結果顯示糖腎方可顯著減少db/db小鼠肝組織脂滴和空泡數(shù)量、改善肝組織結構、減少炎性細胞浸潤，油紅O陽性著色面積減少。
　　2.糖腎方改善db/db小鼠肝臟脂肪變的可能作用機制:
　　2.1糖腎方對db/db小鼠肝組織AMPK/SREBPs及其下游脂肪酸從頭合成靶分子的

10、影響:Western Blot和Confocal結果顯示糖腎方可顯著上調pAMPK水平及抑制轉錄因子SREBP1的表達及入核;糖腎方可顯著下調FAS、SCD1、HMGCR及HMGCS等脂質從頭合成途徑(De novo lipogenesis，DNL)和膽固醇合成關鍵代謝酶的表達，顯著上調pACC蛋白水平和AdipoR1/2基因表達水平;
　　2.2糖腎方對db/db小鼠肝臟與骨骼肌脂質氧化途徑的影響:糖腎方可顯著增加db/db小鼠

11、肝臟脂質氧化關鍵分子Sirt1、PGC1、PPARα、 MLYCD和CPT1A等基因及蛋白表達;糖腎方可以顯著上調脂質氧化相關基因Acox1、Acadm等表達，同時減少LXRα和LOX1的表達;免疫熒光實驗進一步顯示了糖腎方可以降低db/db小鼠肝組織FAS、CPT1A和MLYCD的表達;糖腎方同時可顯著增加db/db小鼠骨骼肌pAMPK、Sirt1、PGC1α和MLYCD的蛋白表達水平;與此同時上調CPT1B、Acadm基因表達和下調

12、Ucp2/3基因表達;糖腎方可降低db/db小鼠肝組織TG水解和FFA轉運相關基因LPL和FAT/CD36的表達水平，降低肝組織FFA和TG濃度;此外，糖腎方可顯著增加db/db小鼠骨骼肌中線粒體生物合成基因Tfam和Esrra的表達水平;
　　2.3糖腎方對db/db小鼠肝組織PI3K/Akt/mTOR信號通路及巨噬細胞活化的影響:糖腎方可顯著增加db/db小鼠肝組織PI3K/Akt蛋白水平和減少pmTOR水平，提示可以改善肝組

13、織胰島素抵抗與mTOR介導的脂質沉積;與此同時糖腎方可顯著增加db/db小鼠肝組織糖原合成水平并下調糖異生途徑中Pck1、G6pc基因表達及上調GK基因表達;糖腎方可顯著下調db/db小鼠肝臟和白色脂肪組織巨噬細胞活化標記物CD68和F4/80基因表達水平;進一步發(fā)現(xiàn)糖腎方可顯著下調白色脂肪組織M1標記物TNFα及Ccl2、Ucp2基因水平，但對M2標記物Mrc1和Arg1無顯著作用。
　　結論:糖腎方可降低db/db小鼠體重及肝