胃內(nèi)的分泌蛋白影響骨質(zhì)代謝的相關(guān)機制研究.pdf

1、目前針對骨質(zhì)疏松癥的藥物干預主要包括兩方面：骨吸收抑制劑和骨和成促進劑。骨吸收抑制劑包括：雌激素、降鈣素、雙磷酸鹽等。這些藥物可以通過抑制破骨細胞的骨吸收功能減少骨量的損失，從而暫時防治骨質(zhì)疏松癥，但是由于骨的更新轉(zhuǎn)化受抑制將導致骨質(zhì)的老化、陳舊。因此治療骨質(zhì)疏松癥不僅需要應(yīng)用骨吸收抑制劑來防止骨量持續(xù)降低，而且還需同時使用刺激骨形成的藥物以增加骨量，可采用聯(lián)合用藥。骨吸收抑制劑只能維持骨量和暫時骨形成增加，應(yīng)用骨形成促進劑才會有效地提

2、高骨量，這也是當前世界治療骨質(zhì)疏松癥新藥研究的主要方向。目前，骨形成刺激劑主要為甲狀旁腺激素，已于2002年由美國FDA批準用于骨質(zhì)疏松癥治療。但已有的PTH制劑價格昂貴，需注射給藥，限制了其推廣應(yīng)用；而且有研究認為PTH的正性作用僅限于脊柱，其他部位可能均為負性效應(yīng)，對骨折風險的影響尚待進一步研究。 總之，針對與胃粘膜中存在的這種促進骨合成活性物質(zhì)的研究及應(yīng)用有著廣闊的研究、開發(fā)前景。然而到目前為止，這種從功能表現(xiàn)方面推測出的

3、胃鈣素到底是什么蛋白，仍舊未知。其性質(zhì)不明則難以針對其進一步研究，難以闡明胃切除或病變誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的作用機制，也就無從采取基于此方面的各種具有針對性的干預措施。因此本課題為試圖闡明胃鈣素的性質(zhì)，展開了一系列探索性研究。 研究目的： 1.觀察胃粘膜提取物對成骨細胞生物學活性的作用。因為成骨細胞是機體骨質(zhì)形成的執(zhí)行者，以往的研究雖然已確定了胃粘膜提取物中含有促進機體骨量增加的因子，但是其對成骨細胞生物學活性的影響尚無研究，

4、所以我們首先要明確胃粘膜提取物是否對成骨細胞的成骨活性有影響，有何影響。 2.對胃鈣素候選蛋白進行篩選，從而確定胃鈣素的性質(zhì)。根據(jù)胃粘膜中促進骨形成因子可受胃泌素調(diào)控，即胃泌素可以促進這種因子釋放的特點，本文采用了蛋白質(zhì)組學技術(shù)，對受胃泌素干預前后，胃粘膜中所差異表達的蛋白進行篩選，試圖從這些差異表達的蛋白中找到這種促進骨形成因子——即胃鈣素。 研究意義： 1.觀察胃粘膜提取物對成骨細胞生物學活性的作用將闡明其促

5、進成骨的作用機制。 2.篩選出胃鈣素并確定其性質(zhì)，將有利于闡明胃切除或病變誘發(fā)骨代謝疾病的機制，有助于加深對骨代謝和OP的病理機制的認識；為防治OP提供新的干預靶點。 擬解決的科學問題: 1.胃泌酸粘膜提取物是否直接通過成骨細胞來實現(xiàn)促進成骨的作用？ 2.胃泌素干預后胃粘膜組織中所表達的差異蛋白有哪些？ 3.胃泌酸粘膜提取物中這種促進骨合成因子——即胃鈣素究竟是什么？ 研究方法：

6、1.采用多次酶消化法，體外分離培養(yǎng)大鼠幼鼠的成骨細胞，利用細胞形態(tài)學觀察、Giemsa染色、堿性磷酸酶染色、鈣結(jié)節(jié)染色、熒光染色等方法對成骨細胞進行鑒定。 2.大鼠胃粘膜組織蛋白的制備。取大鼠胃囊，剝離下胃粘膜組織置于勻漿緩沖液中進行勻漿。離心、棄沉淀，上清液通過一系列空隙從大到小的微孔濾膜進行過濾。濾液離心、棄上清，沉淀溶于鹽水中，超聲冰上震蕩，濾菌、測濃度后以生理鹽水將其稀釋為低（10-3g/l）、中（10-2g/l）、高（

7、10-1g/l）三種濃度，-80℃保存。 3.激光共聚焦顯微鏡觀察。成骨細胞接種于激光共聚焦顯微鏡專用皿中，細胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24小時后行細胞內(nèi)鈣離子的熒光標記。將培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡的載物臺上，觀察施加不同濃度胃粘膜提取物刺激前后細胞內(nèi)熒光強度的變化，獲得反映細胞內(nèi)鈣離子濃度動態(tài)變化的曲線。 4.成骨細胞的增殖觀察。細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種2000個細胞，過夜細胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度的胃粘膜提取物

8、或以生理鹽水作為對照來干預細胞，按照CCK-8試劑盒的方法，采用紫外分光光度儀分別檢測加入刺激因素前，刺激后1天、2天、3天的光密度值。 5.RT-PCR實驗。成骨細胞接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，貼壁、融合更換培養(yǎng)液，以不同濃度的胃粘膜提取物或生理鹽水對照來干預細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。TrizolReagent提取細胞總RNA后測濃度，定量后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR技術(shù)分別擴增出collagen type Ⅰ，osteo

9、calcin和β-actin目的基因。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液，瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察并用凝膠成像分析系統(tǒng)做PCR產(chǎn)物半定量分析。 6.Western-blot檢測。細胞經(jīng)不同濃度胃粘膜提取物干預后分別提取細胞的總蛋白、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉一抗雜交、洗膜、二抗雜交、再洗膜，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，顯影，定影。檢測collagen type Ⅰ，osteocalcin和β-actin蛋白的印跡圖像并用光密度掃描儀半定量分析

10、。 7.蛋白質(zhì)組學實驗。提取胃泌素干預前、后的胃粘膜組織的總蛋白，經(jīng)除鹽、定量等處理后，采用熒光差異雙向電泳技術(shù)（2D-DIGE）分離，經(jīng)質(zhì)譜技術(shù)（MS）分析鑒定出經(jīng)胃泌素干預的胃粘膜組織所差異表達的蛋白。 8.生物信息學技術(shù)分析：利用生物信息學技術(shù)，通過數(shù)據(jù)庫檢索，文獻分析對所鑒定的差異蛋白進行分析，從中找到感興趣的候選蛋，以進一步確定下一步的研究方向。 9.利用Western-blot技術(shù)對蛋白質(zhì)組學所篩選出

11、的蛋白進行驗證。 10.利用免疫組化技術(shù)對所篩選出的蛋白在胃粘膜中的定位及分布情況進行觀察。 結(jié)果： 1.形態(tài)學觀察，堿性磷酸酶細胞化學染色和細胞結(jié)節(jié)染色表明：培養(yǎng)的細胞符合成骨細胞的形態(tài)特征，具有分泌堿性磷酸酶和形成礦化結(jié)節(jié)的生物學行為。 2.激光共聚焦顯微鏡觀察胃粘膜提取物刺激前后細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化：在每個視野中分為4個象限，在每個象限中隨機選取5個細胞，共20個細胞進行觀察，結(jié)果為：對照組細胞內(nèi)

12、的鈣離子濃度無任何變化，低濃度實驗組有15%的細胞（20個細胞中有3個），中濃度組有35%（20個細胞中有7個），高濃度組有95%（20個細胞中有19個）發(fā)生了鈣離子濃度短暫、快速增高的變化。 3.成骨細胞增殖實驗：不同濃度的胃粘膜提取物干預后第一、二、三天的細胞數(shù)量均比對照組增多。經(jīng)統(tǒng)計學分析表明：3個實驗組與對照組比較存在差異，而且差異具有顯著性（p<0.01）。 4.RT-PCR與western-blot實驗：與對

13、照組比較，三組不同濃度的實驗組，均可提高collagen type Ⅰ和osteocalcin的mRNA和蛋白的表達水平，經(jīng)統(tǒng)計學分析其差異存在顯著性（p<0.05）。 5.蛋白質(zhì)組學實驗：經(jīng)胃泌素干預后，胃粘膜組織中差異表達蛋白50個，其中增高表達21個，降低表達29個。經(jīng)質(zhì)譜分析后鑒定出了22個差異蛋白。 6.生物信息學分析：對上述22個差異蛋白進行了亞細胞定位，蛋白質(zhì)之間相互作用預測，以及利用已有的文獻對其功能、作

14、用進行了分析。發(fā)現(xiàn)：蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶A3（Protein disulfide-isomerase A3，PDIA3）經(jīng)胃泌素干預后，在胃粘膜中高度表達；而且其在無機鹽代謝過程中起著重要作用：其作為維生素D3在靶細胞膜上的受體蛋白，存在于腸粘膜細胞，成骨細胞、骨細胞、軟骨細胞、成釉等細胞的膜上。PDIA3與維生素D3結(jié)合后可以快速促進鈣磷在腸道內(nèi)的吸收；誘導軟骨細胞一系列的生化反應(yīng)，包括：細胞膜通透性的改變，鈣離子內(nèi)流，磷脂的翻轉(zhuǎn)，還有蛋

15、白激酶C的激活，還具有促進軟骨細胞分化、細胞外基質(zhì)礦化的作用。另外，其不僅存在于細胞膜上，也在細胞外質(zhì)中有表達。 7.經(jīng)Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃泌素干預后的大鼠胃粘膜中的PDIA3/1，25D3-MARRS蛋白表達量增加，這一結(jié)果與蛋白質(zhì)組學的實驗結(jié)果是一致的，從而從逆向?qū)嶒灲嵌葘Φ鞍踪|(zhì)組學實驗結(jié)果進行了驗證。 8.免疫組化對PDIA3/1，25D3-MARRS在胃粘膜中的定位及分布情況進行觀測發(fā)現(xiàn)：在大鼠和

16、人的胃粘膜下層中的胃腺管內(nèi)遍布PDIA3/1，25D3-MARR蛋白的陽性表達。 結(jié)論： 1.胃粘膜提取物可呈劑量依賴關(guān)系引起成骨細胞內(nèi)的鈣離子迅速短暫地增加。 2.胃粘膜提取物能夠地促進成骨細胞的增殖。 3.胃粘膜提取物可促進成骨細胞的成骨活性。 4.PDIA3/1，25D3-MARRS被認為是胃粘膜組織中促進骨合成作用的關(guān)鍵因素。 5.PDIA3/1，25D3-MARRS是可由胃粘膜內(nèi)

17、分泌的分泌蛋白。 本研究的創(chuàng)新之處： 1.以往的研究發(fā)現(xiàn)胃粘膜提取物具有促進實驗動物骨量的作用，通過本研究項目不但驗證了這一論點，而且闡明其成骨作用是通過直接促進成骨細胞的增殖和分化來完成的。 2.利用胃泌素干預后胃鈣素表達增加的特點，采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)，包括：2D-DIGE，基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對胃鈣素的候選蛋白進行篩選。 3.提出PDIA3可能就是胃組織內(nèi)促進骨合成的活性因子。目前，所謂的