調(diào)節(jié)底物代謝對衰竭心肌代謝重構(gòu)的干預作用及相關(guān)機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 心臟是高耗能器官,心肌細胞需要持續(xù)而巨大的能量供應來保證其收縮功能和自身的需要。研究發(fā)現(xiàn),慢性心力衰竭(Chronic Heart Hailure,CHF)時,心肌代謝將會發(fā)生很大改變,ATP生成不足,處于“能量饑餓”狀態(tài)。線粒體是能量代謝的細胞器,學者們逐漸認識到CHF可能伴隨著線粒體功能障礙,線粒體功能障礙才是CHF心肌代謝紊亂的核心,研究衰竭心肌線粒體改變對揭示CHF能量代謝改變的機制具有重要意義。解耦聯(lián)

2、蛋白2(uncoupling protein2,UCP2),是線粒體內(nèi)膜的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運蛋白,當它被激活時,可產(chǎn)生質(zhì)子的滲漏,使氧化磷酸化解偶聯(lián),ATP合成降低。由于UCP2的生理作用,于衰竭心肌能量缺乏的情況是不利的。研究表明,CHF時UCP2表達增高,且與心肌作功減低相關(guān),其增高原因及在CHF能量代謝障礙中意義有待研究。
　　 CHF時,交感系統(tǒng)活性和兒茶酚胺水平增加,血漿游離脂肪酸(FFA)水平升高,FFA代謝增加對心力衰竭

3、的心肌具有損害作用,過多的FFA在線粒體內(nèi)參加β氧化易引起線粒體氧化應激;同時有研究表明血漿中高濃度的FFA可促進大鼠心肌、骨骼肌UCP2的表達上調(diào),導致產(chǎn)能減少。大型流行病學調(diào)查顯示,高FFA水平與心源性猝死顯著相關(guān),而限制游離FFA和加強葡萄糖的利用,如使用胰島素和/或葡萄糖降低血FFA水平,抗交感活性治療,抑制FFA進入線粒體,或者使用曲美他嗪(TMZ)抑制FFA氧化將改善心肌缺血狀態(tài)。在這種理念的指導下,臨床上使用曲美他嗪治療缺

4、血性心肌病取得了良好的效果,有研究提示長期使用曲美他嗪將改善心衰患者的心功能分級,提高左室功能,我們推測這一作用可能與抑制FFA的利用有關(guān),但其潛在的機制仍不明了,需要進一步研究。
　　 本課題從動物模型和心肌細胞培養(yǎng)兩個層面進行研究,并給予相應的藥物干預,探討CHF時線粒體能量生成、氧化呼吸功能的改變及FFA對其影響和UCP2表達變化在其中的作用及意義,為心衰代謝治療提供新的理論依據(jù)及治療靶點。
　　 研究方法：

5、>　　 1.建立腹主動脈縮窄后心力衰竭大鼠模型,分為心力衰竭組(HF20w組),假手術(shù)組(SH20w組)和正常對照組(N組)。術(shù)后20周后檢測:(1)超聲心動圖:測定舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)及室間隔厚度(IVSTd)和左室后壁厚度(LVPWd),計算左心室射血分數(shù)(EF％);(2)血流動力學指標:測量心率(HR)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力最大上升和下降速率(±dp/dt max),計算平均主動脈壓(MAP);(3)病

6、理蘇木素-伊紅(HE)染色和透射電鏡觀察衰竭心肌病理變化;(4)分離大鼠心肌線粒體,Clark氧電極法測定線粒體氧化活性及電子傳遞鏈活性,HPLC法分析心肌組織內(nèi)高能磷酸鹽含量,羅丹明123法測線粒體膜電位(MMP);(5)測定血FFA含量,RT-PCR、Western-blot檢測心肌UCP2表達變化,并對FFA含量與UCP2表達水平、ATP含量和UCP2表達水平進行相關(guān)分析。
　　 2.分離培養(yǎng)大鼠心肌細胞,然后觀察向培養(yǎng)基

7、中添加不同濃度的FFA(1mmol/l、2mmol/l和4mmol/l)后不同時相點(6h、12h、24h)對細胞凋亡和UCP2表達的影響。其中,用定量RT-PCR和Western-blot檢測UCP2表達情況,Tunnel法檢測細胞凋亡率,Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2的表達情況。
　　 3.構(gòu)建UCP2 RNA干擾腺病毒質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染心肌細胞,分為UCP2干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(siUCP2組)、空白干擾

8、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(siCon組),2組培養(yǎng)條件為2mmol/l FFAs,空白對照組(Con組)正常條件培養(yǎng),設(shè)12h、24h兩個不同時像點,檢測:(1)心肌細胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量;(2)細胞凋亡率;(3)Wsetern-blot檢測UCP2、PPARα、PPARγ及凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2表達。
　　 4.PPARα阻斷劑MK88、PPARγ阻斷劑GW9662預處理大鼠心肌細胞,后以2mmol/lFFAs培養(yǎng),相應分

9、組為:FFAs+MK886組、FFAs+GW9662組及FFAs組,同時設(shè)空白對照組,Wsetern-blot檢測各組UCP2表達變化。
　　 5.20周存活的心衰組大鼠再隨機分為:曲美他嗪治療組(T組,曲美他嗪10 mg·kg-1-d-1)、阿西莫司治療組(A組,5 mg·kg-1-d-1)、心衰對照組(HF組)和假手術(shù)組(SH組),給藥8周后檢測:(1)超聲心動圖(指標同方法1)(2)透射電鏡觀察衰竭心肌超微結(jié)構(gòu)變化;(3)

10、Clark氧電極法測定線粒體氧化活性及電子傳遞鏈活性,HPLC法分析心肌組織內(nèi)高能磷酸鹽含量;(4)測定血腹血葡萄糖及FFA水平;(5)RT-PCR、Western-blot檢測UCP2表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.腹主動脈縮窄術(shù)后20周,HF20w組大鼠心臟超聲提示:心腔輕度擴大、LVEDd明顯增加,EF值顯著降低;血流動力學提示:LVEDP、MAP增高,±dp/dtmax下降;與SH20w組和N組相差顯著,符合

11、心力衰竭表現(xiàn)。
　　 2.與同時間N組和SH20w組比較,HF20w組心肌組織線粒體內(nèi)ATP、ADP、AMP及Pcr含量均降低;線粒體MMP、ST3、PCR水平降低,差異顯著;HF20w組ST4略有增高,但各組間無顯著差異。
　　 3.HF20w組血FFA水平較N組與SH20w組增高約1.7倍;HF20w組大鼠心肌UCP2mRNA、蛋白水平較對照組表達顯著增加;相關(guān)性分析顯示,心肌組織ATP含量與UCP2蛋白表達呈顯著負

12、相關(guān)(r=-0.929);心肌UCP2蛋白表達與血清FFA呈顯著正相關(guān)(r=0.89)。
　　 4.2 mmol/l FFAs培養(yǎng)大鼠心肌細胞6h后,UCP2 mRNA及蛋白表達水平較對照組有所增高,至24h時表達量達頂峰;1,2和4 mmol/l三種濃度FFAs培養(yǎng)心肌細胞12h后UCP2mRNA及蛋白表達水平較對照組均增高。
　　 5.通過RNAi技術(shù)構(gòu)建siUCP2腺病毒表達載體,轉(zhuǎn)染大鼠心肌細胞24h后,siUC

13、P2組UCP2蛋白表達下降了78％,對照組無明顯改變。2mmol/l FFAs培養(yǎng)大鼠心肌細胞12h后:細胞內(nèi)ATP、ADP較對照組均降低,AMP含量略有增高;至24h,ATP、ADP含量進一步降低;siUCP2組ATP含量明顯高于對照組。
　　 6.2mmol/l FFAs培養(yǎng)心肌細胞6h細胞凋亡無明顯增加,至12h、24h細胞凋亡數(shù)量則明顯增加,同時1,2及4 mmol/l FFAs培養(yǎng)心肌細胞24h,細胞凋亡數(shù)量均明顯增加

14、;與對照組相比,2mmol/lFFAs培養(yǎng)心肌細胞12 h、24h,凋亡蛋白bax表達明顯增高,抗凋亡蛋白bcl-2降低,bcl-2/bax比值降低亦(2.041降至0.480);抑制UCP2表達后,心肌細胞凋亡率明顯降低;WB結(jié)果提示:siUCP2組細胞bax表達下降同時bcl-2增高,bcl-2/bax增高(0.48至1.63)。
　　 7.2 mmol/l FFAs培養(yǎng)心肌細胞12、24 h后,Western結(jié)果提示:PP

15、ARα、PPARγ表達水平無明顯改變;使用PPARα阻斷劑MK886和PPARγ阻斷劑GW966230 min預處理心肌細胞,2mmol/l FFAs培養(yǎng)24h,MK886組UCP2 mRNA及蛋白表達水平的增高受到抑制,GW9662組無明顯改變。
　　 8.藥物干預8周后對各組動物進行心臟超聲檢測:T組大鼠EF較HF組、A組有所改善;與HF組相比,A組、T組心肌線粒體ST3及PCR水平明顯改善,T組ATP、ADP、PCr含量亦

16、有所提高,各組間ST4水平無顯著改變。
　　 9.藥物干預后,A組血清FFA明顯降低,HF組和T組FFA水平較SH組仍增高;與SH組相比HF組葡萄萄水平增高,A組與HF組則明顯降低;與HF組相比,T組、A組UCP2mRNA、蛋白表達明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.衰竭心肌發(fā)生代謝重構(gòu):心肌組織腺苷酸含量和PCr含量降低,線粒體呼吸功能發(fā)生改變,MMP降低。細胞能量供應不足、消耗增多可能是心功能減退的直接原因。

17、
　　 2.衰竭心肌UCP2表達增高,并與線粒體ATP含量減少有關(guān),抑制大鼠心肌細胞UCP2表達可減弱高濃度FFA誘導的ATP下降,UCP2表達的增高可能是衰竭心肌ATP生成不足的分子機制之一。
　　 3.UCP2參與了FFA誘導成年大鼠心肌細胞凋亡,抑制UCP2表達后可以減弱FFA誘導的細胞凋亡,同時FFA誘導大鼠心肌細胞UCP2表達是通過PPARα而不是PPARγ實現(xiàn)的。
　　 4.曲美他嗪通過改善線粒體呼吸