釀酒酵母海藻糖代謝工程與抗逆性相關機制研究.pdf

1、乙醇是已被大規(guī)模生產(chǎn)與應用的可再生生物能源之一。但乙醇作為一種新能源物質(zhì)，現(xiàn)生產(chǎn)工藝的能耗與原料消耗高，能源與原料資源利用效率低，工藝廢水量大質(zhì)劣，環(huán)境治理面臨嚴峻挑戰(zhàn)，整體經(jīng)濟社會效益急待提高．因此，通過理論與技術創(chuàng)新，尋求高效清潔生產(chǎn)新工藝成該領域備受關注的熱點．實現(xiàn)高濃度酒精發(fā)酵是提高乙醇生產(chǎn)效率效益的關鍵技術之一。但高濃度酒精發(fā)酵要求生產(chǎn)菌株釀酒酵母具有良好的抗逆性能。在釀酒酵母中，胞內(nèi)海藻糖含量被認為是與其抗逆性能關系密切的一

2、個重要指標。國內(nèi)外研究顯示，酵母細胞可以通過增加海藻糖的合成而抵御不良逆境的傷害。但關于菌株胞內(nèi)海藻糖的積累對其高濃度酒精發(fā)酵性能影響的研究卻鮮有報道。本研究用細胞與分子生物學及基因工程技術改造釀酒酵母海藻糖的代謝相關途徑，增強菌株胞內(nèi)海藻糖積累，構建適于工業(yè)生產(chǎn)的高抗逆釀酒酵母工程菌株。探討海藻糖提高細胞抗逆性的機制。最后通過系統(tǒng)分析HOG(High Osmolarity Glycerol)途徑的基因序列變異，闡釋酵母菌滲透壓耐受性差

3、異的可能機制，為進一步深入開展提高釀酒酵母抗逆性能的研究奠定基礎。主要研究結果如下：
　　 1、海藻糖代謝途徑工程菌株構建從工業(yè)菌株D308中分離得到60株單倍體，并對這些菌株進行發(fā)酵性能及胞內(nèi)海藻糖含量測定，結果顯示二者呈顯著正相關性。構建重組質(zhì)粒改造海藻糖代謝途徑，得到過表達編碼海藻糖-6-磷酸合成酶基因（TPSI）菌株H1 lptpsl、H13ptpsl；敲除編碼海藻糖酸性水解酶基因（ATHl）菌株H11Aathl、H13

4、Aathl;及過表達TPSl同時敲除ATHl基因菌株H11pTAA、H13pTAA。雜交實驗獲得二倍體工程菌株D309ptpsl、D309Aathl及D309pTAA。
　　 2、不同脅迫條件下工程菌株與親株生長及發(fā)酵性能比較二倍體工程菌株D309pTAA不僅結合了優(yōu)良單倍體的性狀，同時增強了胞內(nèi)的海藻糖積累，在高糖、高乙醇、低pH、高溫等脅迫條件下其最大比生長速率比親株D308均有顯著提高，提高范圍為4.92％-9.80％。在

5、高糖、高溫、低pH等條件下，工程菌株的發(fā)酵速率比親株均有較大提高，胞內(nèi)海藻糖含量也均比同一條件的親株高。玉米糖化醪（254.906g/L葡萄糖）發(fā)酵時，工程菌株D309ptpsl、D309Aathl、D309pTAA發(fā)酵82h的乙醇產(chǎn)量分別為117.171g/L、117.135g/L、117.555g/L，比親株D308分別提高了4.71％、4.67％、5.05％；主酵期O-46h期間，以上二倍體工程菌株的乙醇發(fā)酵速率分別為2.253、

6、2.243、2.264(g h-1L-1)，分別比親株提高了13.22％、12.20％、13.76％。
　　 3、海藻糖工程菌株抗逆性高于親株的機制探討從呼吸缺陷型形成比率、細胞膜完整性分析、胞內(nèi)活性氧ROS水平、抗氧化性能及SOD酶（超氧化物歧化酶）活性等五個方面進行了研究分析。在乙醇脅迫下，工程菌株D309pTAA的呼吸缺陷型比率比親株D308顯著減少。D309pTAA在高滲、高溫、低pH、高乙醇等條件脅迫下，細胞膜完整性均

7、高于親株（如高溫50℃處理1h后，其細胞存活率可達48.98％，是親株的1.71倍）；胞內(nèi)ROS積累均比親株低（僅為親株的0.48-0.70倍）；SOD酶活性比親株高9.98％-19.25％，同時5mmol/LH202脅迫下的最大比生長速率比親株提高7.95％。因此，海藻糖提高酵母細胞在脅迫條件下的抗逆性機制可能是通過保護其細胞膜完整性，維持活性氧代謝過程中的關鍵酶活性，以增強菌株的抗氧化能力，進而提高工程菌株的整體抗逆性能。
　

8、　 4、HOG途徑基因變異與菌株高滲耐受力關系研究HOG途徑基因在23株釀酒酵母（包括工業(yè)釀酒酵母H13、黃酒酵母WH1）中的基因多態(tài)性及其在10個酵母菌種間的序列突變，進化分析后發(fā)現(xiàn)HOG途徑中的上游基因序列比下游基因序列更易發(fā)生突變，位于途徑頂端的SLN1與MSB2基因堿基突變數(shù)量顯著高于其它基因，且菌株H13、WH1的MSB2基因中含有一個大片段Indel區(qū)（缺失378bp）．這種現(xiàn)象可能是導致酵母菌株間高滲耐受力差異的分子機制